[发明专利]一种NGS靶向探针捕获法检测呼吸道25种RNA病毒的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种NGS靶向探针捕获法检测呼吸道25种RNA病毒的试剂盒，所述试剂盒包括寡核苷酸混合物，能够与呼吸道病毒种类的遗传材料特异性结合；所述呼吸道病毒种类选自：人呼吸道合胞病毒A，人呼吸道合胞病毒B，甲型流感病毒(H9N2)，甲型流感病毒(H2N2)，甲型流感病毒(H3N2)，甲型流感病毒(H1N1)，甲型流感病毒(H5N1)，甲型流感病毒(H7N9)，乙型流感病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型，副流感病毒3型，副流感病毒4型，人偏肺病毒，人冠状病毒HKU1，人冠状病毒NL63，人冠状病毒229E，人冠状病毒OC43，鼻病毒A，鼻病毒C，鼻病毒B14，人副肠孤病毒1型，人副肠孤病毒6型，人肠病毒C104，人肠病毒C109。

2.根据权利要求1所述的NGS靶向探针捕获法检测呼吸道25种RNA病毒的试剂盒，其中，所述寡核苷酸混合物包含探针组合，所述探针组合能够与所述25种呼吸道病毒种类的遗传材料RNA杂交，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.50所示。

3.根据权利要求1所述的NGS靶向探针捕获法检测呼吸道25种RNA病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含探针保存液TE buffer。

4.一种检测呼吸道25种RNA病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

1)总RNA的提取：采用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取试剂盒，为满足文库构建，提取所需的RNA的浓度不低于5ng/ul且纯度合格；

2)病毒rRNA的去除：首先加入rRNA探针杂交捕获，然后加入RNase和DNase消化掉rRNA和探针，获得mRNA；最后将mRNA打断，并反转录合成一链和二链，再进行文库构建；

3)RNA文库的构建；

4)探针杂交捕获；

5)DNB制备上测序。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，在步骤2)中，所述rRNA的去除按照以下方法实施：取适量0.05-1μg总RNA至Nuclease-free微量离心管中，用Nuclease-free H₂O稀释至11μL(可以根据实际情况调整)，将rRNA Probe(H/M/R)和Probe Buffer从-20℃取出，冰浴解冻后涡旋混匀，加入1ul的rRNA Probe和3ul的Probe Buffer，PCR仪上运行：95℃杂交2min，22℃(95℃-22℃(0.1℃/sec))5min，反应结束后；加入4ul RNase H Buffer，1ulRNase H，37℃30min；反应结束后，加入29ul DNase I Buffer，1ul DNase I，37℃30min；反应结束后，RNA磁珠纯化获得mRNA。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其中，在步骤2)中，所述RNA片段化及一链二链的合成按照以下方法实施：根据获得的mRNA于PCR仪上94℃反应10min(片段大小150bp)，反应结束后，加入1ul Actinomycin D(0.12mg/mL)，6ul 1st Strand Buffer2和2ul 1st StrandEnzyme Mix 2，PCR仪上运行：25℃10min，42℃15min，70℃15min，反应结束后进行二链的合成，即加入25ul 2nd strand Buffer 2(with dUTP)和15ul 2nd strand Enzyme Supermix，PCR仪上运行：16℃30min，65℃15min，二链合成完成后，进行文库的构建。