[发明专利]能从无细胞合成中获得的封闭端DNA载体和用于获得ceDNA载体的方法

权利要求书

1.一种制备封闭端DNA载体的方法，其包含：

提供包含第一ITR的第一单链ITR分子；

提供包含第二ITR的第二单链ITR分子；

提供包含表达盒序列的双链多核苷酸；以及

将所述第一ITR分子的5'和3'末端连接至所述双链分子的第一末端，并将所述第二ITR分子的5'和3'末端连接至所述双链分子的第二末端以形成所述DNA载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个是合成的。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链表达盒序列是通过从包含所述表达盒序列的双链DNA构建体上切除而获得的。

4.根据权利要求3所述的方法，其中在所述双链DNA构建体中，所述表达盒序列在所述5'末端侧接第一限制性核酸内切酶裂解位点，并且在所述3'末端侧接第二限制性核酸内切酶裂解位点。

5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述双链DNA构建体是杆粒、质粒、微环或线性双链DNA分子。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一限制性核酸内切酶和所述第二限制性核酸内切酶是相同的限制性核酸内切酶。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一限制性核酸内切酶和所述第二限制性核酸内切酶是不同的限制性核酸内切酶。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在连接至所述表达盒序列之前将所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个退火。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个包含分别与所述表达盒序列的所述第一末端或所述表达盒序列的所述第二末端互补的悬垂区域。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接选自化学连接和蛋白质辅助连接。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述连接是通过T4连接酶或AAV Rep蛋白实现的。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一ITR选自野生型ITR和修饰ITR。

13.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第二ITR选自野生型ITR和修饰ITR。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个包含至少一个RBE位点。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个为AAV ITR或AAV衍生的ITR。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一ITR的序列选自表4B或表5中阐述的任何左ITR序列或SEQ ID NO:2、5-9、32-48。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二ITR的序列选自表4A或表5中阐述的任何右ITR序列或SEQ ID NO:1、3、10-14、15-31。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达盒序列包含至少一个顺式调节元件。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述顺式调节元件选自由启动子、增强子、转录后调节元件和多聚腺苷酸化信号组成的群组。