[发明专利]一种热稳定性增强的醇脱氢酶突变体及其序列

说明书

本发明涉及一种热稳定性增强的醇脱氢酶突变体，其源于Lactobacillus parabuchneri的野生型醇脱氢酶，与SEQ ID NO.5具有90％以上相似性，且具有以下特征中的一个或多个突变：K49R，N90S，F147E，T152A，S169V。醇脱氢酶突变体的序列SEQ ID NO.4。编码醇脱氢酶突变体的多核苷酸的碱基序列为SEQ ID NO.3。多核苷酸包含在重组质粒中，重组质粒包含在宿主细胞中。本发明的重组醇脱氢酶突变体具有更好的热稳定性，适用于较高温度下的NADH(NADPH)的循环再生。与目前发现的醇脱氢酶相比，本发明的醇脱氢酶突变体在45℃－65℃的活性更持久，具有更好的热稳定性，因此更适合于工业化应用。

技术领域

本发明涉及一种醇脱氢酶突变体，具体涉及一种热稳定性增强的醇脱氢酶突变体及其序列。

背景技术

氧化还原酶在制备手性醇、氨基酸等方面的应用越来越多。但在其催化的反应中，90％需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，NADH)，或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP，NADPH)做为辅酶。因此在氧化还原酶的应用中，还需要低成本、高效的辅酶再生体系。

热稳定性增强后的生物催化剂有许多优点。(1)加快动力学反应，能有效缩短反应周期。(2)简化了酶提取流程，宿主细胞蛋白在高温下变性凝结沉淀，易与目的蛋白分离。(3)对反应的冷却系统要求不高，因而降低了能耗并降低了成本。(4)稳定性提高后的蛋白可在室温下运输保存，并且有效延长保质期。(5)在高温催化反应的条件下，避免了杂菌的生长机会，从而减少了细菌的代谢产物对产品的污染。(6)高温有助于增加底物的溶解度，提高了单位体积的生产效率。

醇脱氢酶是一种多用途催化剂，通过醛或酮的对映体选择性还原成对应醇。(R)特异性醇脱氢酶与(S)特异性醇脱氢酶具有不同特性，并且这些催化剂在光学活性醇的工业合成中被越来越频繁地用到。旋光性是许多医药和农药活性化合物选择性作用的必要条件，在一些情况下，一个对映体具有有益的药物活性，另一个对映体却具有基因毒性作用。因此，在药用和农药用活性化合物的合成中，需要使用具有所要求的立体特异性的催化剂合成光学活性醇。

L-2-氨基丁酸是一种非天然氨基酸，其是用于合成一些重要药物的关键手性中间体。例如，其可以被转变成S-2-氨基丁酰胺，S-2-氨基丁酰胺是抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦的直接前体。L-2-氨基丁酸还可以被转变为S-2-氨基丁醇，S-2-氨基丁醇是用于合成抗结核病化合物乙胺丁醇的化学中间体。L-2-氨基丁酸的生物法制备中辅酶占据了相当比例，以甲酸脱氢酶－甲酸铵辅酶循环工艺为例，制备每公斤产物需消耗1.2g-2g NAD，折合7-12人民币/公斤产品。因此提高辅酶的循环效率并减小辅酶用量对降低L-2-氨基丁酸生产成本具有积极意义。

阿托伐他汀钙(商品名LIPITOR)、罗苏伐他汀钙(商品名CRESTOR)以及匹伐他汀(商标名Lipalo)，是重要的降胆固醇他汀类药物。而手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯是重要的他汀类药物的关键手性中间体。在已知的制备这些手性中间体的诸多途径中，包括化学法和酶法，都具有很多缺点。采用酶法制备及手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯需要使用具有立体选择性的酮还原酶，但现有的野生型酮还原酶催化活性较低，辅酶循环效率不足，使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。

阿扎那韦，以商品名Reyataz出售，是一种用于治疗和预防艾滋病毒/艾滋病的抗逆转录病毒药物，是目前世界上主要的抗艾滋病药物之一。它在世界卫生组织的基本药物清单上，是基本卫生系统所需的最重要的药物。百时美施贵宝公司最早开发了阿扎那韦(CN10282508C)，美国FDA在2003年批准其上市，中国也于2007年批准其上市。(2R,3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇做为制备阿扎那韦的关键中间体，目前主要生产工艺有化学合成法和生物合成法两种，其中生物法可由相应的醇脱氢酶生物转化3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇获得，其制备过程既涉及到酮的立体特异性还原，又涉及到了辅酶的循环再生。