[发明专利]一种新型转基因植物标记基因构建及应用

说明书

本发明公开了一种转基因植物用的新型融合标记基因研究。具体过程是：在两个基因的连接处引入了口蹄疫病毒（FMDV）20个氨基酸组成的2A寡肽序列（2A oligopeptide）(QLLNFDLLKLAGDVESNPGP)。在真核细胞内，该寡肽在C端发生切割。利用FMDV2A连接肽编码序列串联绿色荧光蛋白GFP基因，潮霉素抗性基因HPT和除草剂抗性基因Bar，构建三种标记基因的组成型表达单元，并插入植物表达载体，转基因植物中均能够检测到GFP基因、HPT基因和Bar除草剂抗性基因的表达。利用本发明，可以多种方法筛选转基因阳性植株，有利于转基因植株后代纯合以及假阳性材料的剔除。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体地说利用FMDV 2A连接肽串联标记基因的方法，通过对串联的基因分别进行验证，以确定该植株为转基因阳性。

背景技术

外源基因转化到植物需要通过不同阶段的筛选标记来确认，不同筛选标记容易获得真实的转基因植株，但是植物基因表达需要启动子和终止子配套，因此多个标记基因构建比较繁琐。在植物基因表达载体构建过程中，往往由于载体表达组件的缺少或多克隆位点酶切位点的稀少而使目的基因植物表达载体构建受到限制。为了在植物表达载体中使用多个标记基因，增加转基因植物的筛选可信度，本项目利用口蹄疫病毒(FMDV)2A/2B连接区分别将潮霉素抗性基因（HPT）与Bar抗草胺膦抗性基因串联构成双筛选标记的融合基因，将潮霉素抗性基因（HPT）、Bar抗草胺膦抗性基因以及绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联构成双筛选标记和报告基因融合的3基因系统。

目前多基因表达策略主要包括表达融合蛋白，构建多顺反子表达载体等。利用内部核糖体进入位点IRES (internal ribosome entry site)或FMDV 2A 连接两个或多个基因，可以在真核系统中实现基因的共表达。利用IRES介导的多顺反子表达结构较大，其应用常受到载体容量的限制，当IRES被置于相邻基因中间时有助于双顺反子蛋白的表达，但IRES对位于其后的基因翻译起始能力相对较弱。在多顺反子蛋白的表达中可以用FMDV 2A来代替IRES。

FMDV2A 蛋白约18 个氨基酸残基，具有自我剪切活性，其共翻译剪切活性是在自己的C端切割FMDV多聚蛋白，通过核糖体跳跃使2A蛋白和它的下游蛋白发生不连续的翻译(Donnelly, J. Gen. Virol, 2001, 82： 1027-1041; J. Gen. Virol, 2001, 82：1013-1025)，2A片段的氨基酸连接到上游蛋白C端，一个脯氨酸连接到下游蛋白的N端(Hasegawa,Stem Cells, 2006, 24: 2649-2660) 。 目前已在哺乳动物细胞、植物和酵母中观察到2A介导的对多聚蛋白的自我剪切作用。2A 介导的相邻基因表达产物通过翻译跳跃来实现分离。