[发明专利]一种基于G-四链体探针结构解旋的可视化识别microRNA的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于G‑四链体探针结构解旋的可视化识别microRNA的检测方法。本发明将G‑四链体与血红素结合后的催化特性和G‑四链体的结构变化进行结合构建的信号衰减方法能够区分单碱基错配和多碱基错配的miRNA，同时能够区分不同miRNA家族成员。在信号衰减的基础上灵敏度仍能达到4.5nmol/L。本发明所使用探针设计简单，不涉及复杂反应过程。本发明对于miRNA的检测有重要意义。

技术领域

本发明涉及涉及核酸检测领域，具体涉及一种基于G-四链体探针结构解旋的可视化识别microRNA的检测方法。

背景技术

microRNA(以下简称miRNA)是一类广泛存在于真核生物中长度约22～23个核苷酸非编码、单链小RNA。在不同细胞或组织类型中miRNA表达水平不同，广泛参与不同的生理活动，其主要通过完全降解或翻译抑制靶基因可以调控细胞增生、分化和凋亡。miRNA作为抑癌基因或原癌基因通过调节凋亡蛋白、激酶和其他肿瘤诱导因子等的表达来参与肿瘤的发生发展，因此异常的miRNA表达被认为是肿瘤或疾病的特征。

目前miRNA已经作为肿瘤分子标志物被用来研究肿瘤诊断和治疗的靶点，那么关于miRNA的高灵敏检测则为肿瘤早期诊断的重要依据。由于miRNA本身具有长度短，丰度低，易降解并且同源miRNAs相似度高的特点，现在大多数研究致力于信号放大或目标转换的方法来弥补miRNA的缺陷，其中包括聚合酶链式反应(PCR)，滚环扩增反应(RCA)，纳米粒子聚集和荧光能量转移等方法，但这些方法反应过程复杂，制作费用高昂，不能全面满足应用需求。为丰富现在已有的miRNA高灵敏检测方法，同时为以后能选择有效合适的检测方法提供更多可能性，需要开发一种设计简单，操作方便不依赖昂贵仪器，且高特异性识别miRNA的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于G-四链体探针结构解旋的可视化识别microRNA的检测方法。

第一方面，本发明保护一种检测microRNA的方法，包括如下步骤：合成探针；所述探针由结合区段和信号区段组成；所述结合区段为与目标microRNA的全长序列反向互补的DNA片段；所述信号区段为可形成G-四链体结构的DNA片段；

如果所述探针与待测样本进行DNA/RNA杂化反应后可以招募DNA聚合酶对探针的G-四链体结构进行解旋复制使其转变为双链结构，则待测样本中含有目标microRNA；反之，待测样本中不含有目标microRNA。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

(1)合成上述探针；

(2)取步骤(1)所述探针，经过退火使所述探针的信号区段形成G-四链体结构；

(3)将步骤(2)的探针与待测样本进行DNA/RNA杂化反应；

(4)完成步骤(3)后，向反应体系中加入DNA聚合酶进行解旋扩增反应；

(5)完成步骤(4)后，向反应体系中加入血红素进行反应；血红素可与未解旋的G-四链体结构结合形成具有催化功能的复合物；

(6)完成步骤(5)后，向反应体系中加入ABTS和H₂O₂进行催化反应后检测420nm处吸收值；

所述方法设置空白对照；所述空白对照采用水替代待测样本；将待测样本在420nm处吸收值记为A，将空白对照在420nm处吸收值记为A₀；A₀-A的数值越大，待测样本中目标miRNA的含量越多。

同时，还可通过观察空白对照的反应体系颜色和待测样本的反应体系颜色来判断目标miRNA的存在情况；空白对照的反应体系颜色为绿色，待测样本的反应体系颜色与空白对照相比颜色越浅，待测样本中目标miRNA的含量越多。