[发明专利]从肿瘤组织检测ALK基因酪氨酸区高表达的方法及其试剂盒在审
| 申请号： | 201910494178.9 | 申请日： | 2019-06-09 |
| 公开（公告）号： | CN110229874A | 公开（公告）日： | 2019-09-13 |
| 发明（设计）人： | 班贵宏;祝令香;郭永;卢临萍;杨文军;高娜 | 申请（专利权）人： | 新羿制造科技（北京）有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851;C12Q1/6886 |
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| 地址： | 102200 北京市昌平*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 高表达 基因 肿瘤组织 酪氨酸 探针 外显子拼接 下游引物 试剂盒 靶标 扩增 检测 基因上游引物 酪氨酸激酶区 临床治疗应用 靶向药物 快速检测 上游引物 荧光基团 准确检测 融合 引物 伴侣 | ||
1.一种从肿瘤组织检测ALK基因酪氨酸区高表达的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：从肿瘤组织获得RNA样本；
步骤2：在ALK基因mRNA断裂位置3'端之后的至少二个相邻外显子区域和参照基因mRNA中分别筛选待测靶标区域；
步骤3：对步骤2中筛选的靶标区域分别设计相应的引物对和探针，其中ALK基因上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端，所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域，使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域；所述ALK基因的探针和所述参照基因的探针分别用不同的荧光基团进行标记；
步骤4：对步骤2中所述筛选的待测靶标区域进行微滴式数字PCR扩增；和
步骤5：根据所述ALK基因和所述参照基因的不同荧光染料标记的阳性PCR产物液滴数的比例，来判断肿瘤组织是否存在ALK基因酪氨酸区高表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的待测靶标区域不含有SNP位点、无重复序列和GC含量为40-60％。
3.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述引物对和探针的长度范围为10-30bp，优选地为13-20bp。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中设计ALK基因mRNA的引物对和探针时，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子23，下游引物位于ALK基因外显子24，所述探针位于ALK基因外显子23-24拼接区域。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述ALK基因上游引物为SEQ ID NO：1：TCTGAACAGGACGAACTGGA；所述ALK基因下游引物为SEQ ID NO：2：TGGTGGTTGAATTTGCTGA；和所述ALK基因探针为SEQ ID NO：3：CTCATGGAAGCCC。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中设计参照基因mRNA的引物对和探针时，其中参照基因上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端，所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域，使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述参照基因是人管家基因，优选地为GAPDH、β-action或ABL1基因。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述参照基因是GAPDH基因，扩增其的待测靶标区域上游引物包括其外显子3和4的拼接区域，下游引物位于其外显子5区域，和探针位于外显子4区域。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述上游引物是SEQ ID NO：5：CATCTTCCAGGAGCGAGATC；所述下游引物是SEQ ID NO：6：ATGGTTCACACCCATGACGA；和所述探针是SEQ ID NO：4：GTACGTCGTGGAGTC。
10.一种从肿瘤组织检测ALK基因酪氨酸区高表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-9任一所述方法中所使用的引物对和探针。
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