[发明专利]一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法

说明书

本申请涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法。具体而言，该制备方法使用含有无机氮源和至少一种氨基酸的发酵培养基对重组大肠杆菌表达菌株进行培养。采用本申请提供的制备方法，使得质粒稳定性高且发酵液中rhG‑CSF产量高。另外，本申请提供的培养基成分明确，控制策略简单，简化了工艺，降低了成本，提高了蛋白表达量，并增加了产品质量，有利于实现工业化生产。

技术领域

本申请属于生物医药领域，具体涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte-colony stimulating factors，hG-CSF)由单核巨噬细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞合成，其主要作用机理：(1)特异地作用于骨髓粒细胞巨噬细胞的前驱细胞(CFU-GM)，促进其向成熟粒细胞分化、增殖；(2)作用于骨髓成熟中性粒细胞，促进其从骨髓向外周血释放；(3)激活成熟粒细胞的功能，增强其游走、吞噬及杀菌能力，延长其存活时间；(4)刺激骨髓造血干细胞向外周血释放。因此，在临床上，hG-CSF用于由癌症化疗和白血病患者骨髓移植后的中性粒细胞增加。

关于hG-CSF的生产，基因工程构建菌株来表达重组hG-CSF(recombinant hG-CSF,rhG-CSF)是现在规模化生产的主要方法。国内外大多采用大肠杆菌来生产rhG-CSF，pET表达系统，功能强大，可采用诱导剂控制表达，使用广泛。使用大肠杆菌表达外源蛋白时，发酵培养基大多数为LB复合培养基，但LB复合培养基在表达重组蛋白时有一系列缺点，其一：LB复合培养基的主要成分之一是酵母粉，其中掺杂着微量的乳糖，容易引起泄露表达现象。特别是在表达毒性蛋白时，在诱导后期质粒容易丢失，影响产量的同时，增加工艺控制的困难。其二：LB复合培养基本身营养成分不清楚，且容易带来氨基酸替换杂质。

利用LB复合培养基生产目的蛋白引起泄露表达和质粒丢失的文献资料较多。例如，Liang hui Jia等人利用重组大肠杆菌在LB复合培养基或YT培养基发酵表达重组蛋白GST-hPTH时发现，当培养基中含有大量的酵母粉时，发酵接种1h～2h后就能检测到有目的蛋白，同时也会导致细胞活力下降和质粒丢失。涉及重组表达hG-CSF的相关专利中，专利CN100363500C、CN103233053B、CN102154189B等均采用LB培养基进行发酵表达。如上文所述现有技术中普遍采用大肠杆菌在复合LB培养基或自诱导培养基上发酵表达重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)，由此会带来发酵过程中菌株的质粒稳定性低、泄露表达严重以及氨基酸替换杂质含量高等一系列问题。

专利GB2241505B公开了一种培养基中加氨基酸如“亮氨酸和苏氨酸”来培养大肠杆菌制备多肽的方法，其中亮氨酸和苏氨酸可以抑制宿主细胞的生长，可选的实施方案中还可以加如一些物质刺激宿主细胞的生长，包括酪蛋白水解物或者异亮氨酸等。

如何通过发酵培养基及发酵策略的控制来达到增加大肠杆菌对rhG-CSF蛋白表达的目的且减少发酵杂质的产生，同时保证质粒的保有率，解决现有技术中存在的问题，一直是本领域的难题。

发明内容

本申请提供一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，通过本发明提供的方法可以提高大肠杆菌对rhG-CSF蛋白表达量，避免质粒丢失，减少杂质的产生。

本申请提供一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，包含使用发酵培养基对重组大肠杆菌表达菌株进行发酵培养的步骤，其特征在所述发酵培养基含有至少一种氨基酸，且其氮源选自无机氮源，所述重组大肠杆菌表达菌株包含编码粒细胞集落刺激因子的核酸序列。

本申请中所述的发酵培养基不含有机氮源，有机氮源通常是指花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、胰蛋白胨、鱼粉、蚕蛹粉、蛋白胨、麸皮、废菌丝体等物质。

本申请中所述的使用发酵培养基对重组大肠杆菌表达菌株进行发酵培养的步骤区别于诱导表达。