[发明专利]一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法

权利要求书

1.一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，包含使用发酵培养基对重组大肠杆菌表达菌株进行发酵培养的步骤，所述重组大肠杆菌表达菌株包含编码粒细胞集落刺激因子的核酸序列；所述发酵培养基的成分及其浓度为：葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾7.5g/L，磷酸氢二钾15g/L，柠檬酸2g/L，硫酸铵2.5g/L，七水合硫酸镁2g/L，甲硫氨酸5g/L，正亮氨酸5g/L，微量元素水溶液，余量为水。

2.根据权利要求1所述的制备方法，所述的微量元素水溶液包含七水合硫酸亚铁、四水合氯化锰、七水合硫酸钴、二水合氯化钙、二水合氯化铜、七水合硫酸锌、盐酸。

3.根据权利要求2所述的制备方法，所述的微量元素水溶液的成分的含量为1.0-3.5g/L七水合硫酸亚铁，1.0-4.0g/L四水合氯化锰，1.5-4.5g/L七水合硫酸钴，0.5-4.0g/L二水合氯化钙，0.1-1.0g/L二水合氯化铜，0.1-1.0g/L七水合硫酸锌，1mol/L盐酸，余量为水。

4.根据权利要求1所述的制备方法，所述发酵培养为分批补料式培养，包含用根据权利要求1-3任一项中所述的培养基初步培养后加入补料培养基继续培养的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，所述补料的培养基的组成为葡萄糖水溶液和硫酸铵水溶液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，所述的补料培养基的组成为30％-70％葡萄糖，15-45g/L硫酸铵，余量为水。

7.根据权利要求6所述的制备方法，所述的补料培养基的组成为40％-60％葡萄糖，25-40g/L硫酸铵，余量为水。

8.根据权利要求7所述的制备方法，所述的补料培养基的组成为50％葡萄糖，30g/L硫酸铵，余量为水。

9.根据权利要求6所述的制备方法，还包含重组大肠杆菌表达菌株种子培养、诱导表达的步骤，且在诱导表达过程中流加补料培养基。

10.根据权利要求9所述的制备方法，补料培养及诱导表达阶段，葡萄糖与硫酸铵的流加速率比为10:1-1:1。

11.根据权利要求10所述的制备方法，补料培养及诱导表达阶段，葡萄糖与硫酸铵的流加速率比为5:1-1:1。

12.根据权利要求11所述的制备方法，补料培养及诱导表达阶段，葡萄糖与硫酸铵的流加速率比为2:1。

13.根据权利要求10所述的制备方法，补料培养阶段葡萄糖的流加速率为0.05-0.20mL/(L·min)，诱导表达过程中葡萄糖的流加速率为0.20-0.40mL/(L·min)。

14.根据权利要求13所述的制备方法，补料培养阶段葡萄糖的流加速率为0.08-0.18mL/(L·min)。

15.根据权利要求13所述的制备方法，诱导表达过程中葡萄糖的流加速率为0.20-0.30mL/(L·min)。

16.根据权利要求12-15任一项所述的制备方法，发酵培养4-10h后待溶氧反弹后，补加补料培养基继续发酵2-6h，发酵培养的菌株至OD₆₀₀为20-30时开始诱导培养，诱导表达时间为3-8h。

17.根据权利要求16所述的制备方法，补加补料培养基前发酵培养时间为5h-8h。

18.根据权利要求16所述的制备方法，补加补料培养基继续发酵3h-5h。