[发明专利]电生理试验中记录微小电流的方法

说明书

本发明公开一种电生理试验中记录微小电流的方法，其具体步骤如下：外源转运蛋白在细胞中表达后，将细胞钳制于‑70 mV，每隔70 S施加时长1.5 S、电压区间从‑160 mV到+20 mV变化的ramp程序以获取转运蛋白在不同条件下的电流响应特征，通过监控两次无铵条件下的电流重现性（基线波动控制在<5 nA）以及加铵下的电流重现性（电流波动控制在<10 nA或<5%，达到仪器的最低检测限），获得稳定可靠的铵转运蛋白底物诱导的微小电流，进而可检出<20 nA的微小电流变化；与传统的Gap‑free以及Step记录模式相比，本申请提供的记录方法极大的提高了数据获取的可靠性及便利性，可为利用电生理技术研究包括铵转运蛋白在内的各类转运体蛋白的功能提供有力技术支撑。

技术领域

本发明属于生物技术领域。本发明涉及电生理试验中稳定记录转运体蛋白所产生的微小电流的方法。

背景技术

植物对NH₄⁺-N吸收是由铵转运蛋白(ammonium transporter,AMT)负责完成的(Ludewig,U.,B.,and Dynowski,M.(2007).Molecular mechanisms of ammoniumtransport and accumulation inplants.FEBSLetters 581,2301-2308.)。双电极电压钳电生理技术在解析AMT底物吸收机制以及调控机制方面具有独特优势，且在AMT功能研究中已经有广泛的应用。值得注意的是，电生理记录得到的AMT底物诱导的电流(吸收信号)一般在200-300nA以下，这种吸收信号的幅度远小于离子通道产生的吸收信号幅度(至少&gt;3000nA)。因此应用该技术研究AMT功能的难点在于如何建立一种稳定快捷的记录体系，以保证获得可靠的微小吸收信号，进而表征AMT的功能及其调控特征。

目前AMT电生理试验中常用的记录模式为“Gap-free”和“Step”两种模式(Ludewig,U.,von Wirén,N.,and Frommer,W.B.(2002).Uniport ofNH₄⁺by the root hairplasma membrane ammonium transporter LeAMT1；1.Journal of Biological Chemistry277,13548-13555.Wood,C.C.,Porée,F.,Dreyer,I.,Koehler,G.J.,and Udvardi,M.K.(2006).Mechanisms of ammonium transport,accumulation,and retention in ooyctesand yeast cells expressing Arabidopsis AtAMT1；1.FEBS Letters 580,3931-3936.R.,Alsterfjord,M.,MacAulay,N.,and Zeuthen,T.(2009).Ammonium iontransport by the AMT/Rh homolog TaAMT1；1is stimulated by acidic pH.PflügersArchiv-European Journal of Physiology 458,733-743.Ortiz-Ramirez,C.,Mora,S.I.,Trejo,J.,and Pantoja,O.(2011).PvAMT1；1,a highly selective ammoniumtransporter that functions as H⁺/NH₄⁺symporter.Journal of Biological Chemistry286,31113-31122.)。现有报道中已经利用“Gap-free”记录模式对番茄LeAMT1；1、拟南芥AtAMT1；1、小麦TaAMT1；1以及菜豆PvAMT1；1的功能进行了研究。这种记录模式的优点是：实时监控不同条件下的电流响应，并获得稳定可靠的微小吸收信号数据。但该方法只能得到一个膜电位下的电流数据，无法获取不同膜电位下的电流-电压关系曲线这一电生理中重要指标(Ludewig,U.,von Wirén,N.,and Frommer,W.B.(2002).Uniport of NH₄⁺by theroot hair plasma membrane ammonium transporter LeAMT1；1.Journal of BiologicalChemistry 277,13548-13555.Wood,C.C.,Porée,F.,Dreyer,I.,Koehler,G.J.,andUdvardi,M.K.(2006).Mechanisms of ammonium transport,accumulation,andretention in ooyctes and yeast cells expressing Arabidopsis AtAMT1；1.FEBSLetters 580,3931-3936.R.,Alsterfjord,M.,MacAulay,N.,and Zeuthen,T.(2009).Ammonium ion transport by the AMT/Rh homolog TaAMT1；1is stimulated byacidic pH.Pflügers Archiv-European Journal ofPhysiology 458,733-743.Ortiz-Ramirez,C.,Mora,S.I.,Trejo,J.,and Pantoja,O.(2011).PvAMT1；1,a highlyselective ammonium transporter that functions asH⁺/NH₄⁺symporter.Journal ofBiological Chemistry 286,31113-31122.)。Step模式则可以获得不同膜电位下的电流-电压关系曲线。但是这种记录模式是非连续的，只能获得完全无铵、完全有铵、恢复完全无铵后等瞬时状态下的电流-电压关系曲线，不能实时监控记录得到的数据是否稳定可靠(Ludewig,U.,von Wirén,N.,and Frommer,W.B.(2002).Uniport of NH₄⁺by the roothair plasma membrane ammonium transporter LeAMT1；1.Journal of BiologicalChemistry 277,13548-13555.Wood,C.C.,Porée,F.,Dreyer,I.,Koehler,G.J.,andUdvardi,M.K.(2006).Mechanisms of ammonium transport,accumulation,andretention in ooyctes and yeast cells expressing Arabidopsis AtAMT1；1.FEBSLetters 580,3931-3936.R.,Alsterfjord,M.,MacAulay,N.,and Zeuthen,T.(2009).Ammonium ion transport by the AMT/Rh homolog TaAMT1；1is stimulated byacidic pH.Pflügers Archiv-European Journal of Physiology 458,733-743.Ortiz-Ramirez,C.,Mora,S.I.,Trejo,J.,and Pantoja,O.(2011).PvAMT1；1,a highlyselective ammonium transporter that functions asH⁺/NH₄⁺symporter.Journal ofBiological Chemistry286,31113-31122.)。因此，在实际操作中，Step模式获取的数据重现性较差，两次重复间波动很大，对于微小电流的AMT功能研究非常不利。事实上，由于各种因素(如物理性震动)可能引起电流信号的波动，单独利用Step模式进行记录往往会得到“假电流”(即记录得到的所谓铵诱导电流不是AMT引起的，而是一些机械震动导致的)，对初学者极易造成误导。