[发明专利]一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器及应用

说明书

本发明涉及一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器及应用，属于生物分子检测技术领域。具体是将流感病毒颗粒作为模板分子固定于96孔酶标板，聚合一薄层聚苯胺以印迹模板病毒，模板分子经洗脱，留下的二维印迹空穴，可特异性识别目标病毒，利用HRP作为生物标记物直接标记于固载在印迹膜上流感病毒的表面，HRP能有效催化H₂O₂‑OPDA体系产生灵敏的荧光效应，所产生的荧光强度与流感病毒浓度有直接关系，从而构建一种新型流感病毒荧光传感器，所制备的印迹聚合物膜具有人工抗体特性，可用于流感病毒的识别与检测，并成功应用于血清样品的检测。该传感器提供了一种高稳定性、高特异性、高灵敏的流感病毒识别与检测方法。

技术领域

本发明涉及一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器及应用，属于生物分子检测技术领域。

背景技术

流行性感冒病毒，简称流感病毒，属于正黏液病毒科，是一种单股负链RNA病毒，它会造成急性上呼吸道感染，并通过呼吸、讲话等途径借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。新的亚型流感病毒造成的流感大流行威胁到人类的健康，随着人类经济及文化的全球化，为流感全球性大流行创造了合适的条件。为实现流感病毒传播的潜伏期进行检测与预防，一些简便的仪器及快速低成本的检测方法受到极大关注。预防流感病毒和可能的流感大流行的最重要的先决条件是尽早隔离，检测病毒核酸存在。发展新型流感病毒检测方法意义重大，重在改善方法的条件和属性，以达到易操作，便携式仪表，快速测试和低成本等要求。

分子印迹技术，是模拟自然界所存在的分子识别作用，制备包裹模板分子的聚合物网状结构的人工受体，它是涉及高分子化学、生物化学、材料化学、分析化学等学科的一种用于分离纯化的先进技术。 基于“分子印迹聚合物（MIPs）”取代生物分子作为识别元件仿生传感器， 在 21 世纪逐渐成为传感器领域的研究热点， 可望在将来逐步取代不稳定的传统生物传感器。迄今，分子印迹技术已被成功应用于小分子识别，由于生物分子的特殊性质，如大的分子尺寸，复杂的空间结构，大量的功能基团，水溶性等，对生物分子的印迹技术仍然为国内外研究的重点与难点。当目标物分子尺寸进一步放大到病毒颗粒时，又将遇到新的困难与挑战，因此关于分子印迹技术在病毒中的应用少有报道。然而由病毒引起的疾病不容小觑，如流感病毒引起的大流行，严重危害到人类健康，甚至是生命安全。这种仿生识别技术在病毒的制备、诊断及最终治疗方面具有一定的潜在应用。

传统的酶联免疫分析（ELISA）是将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，利用其对目标物的特异性识别能力，采用酶标记技术进行信号的转换和放大，达到定性与定量分析的目的。如能将这种具有人工抗体性质的分子印迹材料与免疫技术相结合，将为生物分子分析提供一个全新的手段，而这一手段的优势在于对那些低丰度或难以获取抗体的生物分子可以实现直接的分析与检测，所消耗的模板分子量少，且有着比抗体更好的稳定性和重复性，一定程度上可以取代免疫分析中的抗体。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器，并将其应用于血清样品的检测。该荧光传感器提供了一种高特异性，高灵敏的流感病毒识别与检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

将一定量流感病毒作为模板分子固定于96孔酶标板上，接着制备一层聚苯胺分子印迹膜，洗去模板病毒，形成的分子印迹膜可特异性识别目标病毒，并通过辣根过氧化物酶HRP标记于固载在印迹膜上流感病毒的表面，被吸附的HRP催化过氧化氢 (H₂O₂) –邻苯二胺(OPDA) 体系产生灵敏的荧光效应，从而构建一种新型流感病毒荧光传感器，可用于血清样品中流感病毒的识别与检测。

所述一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器的制备，具体步骤如下：

1） 模板分子的固定：于96孔酶标板中，每孔加入30 μL一定浓度的流感病毒，室温孵育1小时，超纯水洗去未键合的病毒颗粒；