[发明专利]一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器及应用

权利要求书

1.一种96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器，其特征在于：将一定量流感病毒作为模板分子固定于96孔酶标板上，接着制备一层聚苯胺分子印迹膜，洗去模板病毒，形成的分子印迹膜可特异性识别目标病毒，并通过辣根过氧化物酶HRP标记于固载在印迹膜上流感病毒的表面，被吸附的HRP催化过氧化氢 H₂O₂ –邻苯二胺 OPDA体系产生灵敏的荧光效应，从而构建一种新型流感病毒荧光传感器。

2.根据权利要求1所述的96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器，其特征在于：包括以下步骤：

1） 模板分子的固定：于96孔酶标板中，每孔加入30 μL一定浓度的流感病毒，室温孵育1小时，超纯水洗去未键合的病毒颗粒；

2）分子印迹膜的制备：苯胺与过硫酸铵APS的摩尔比例为3∶1，在试剂管中预聚合，并加入到步骤（1）处理后的96孔酶标板的板孔中，每孔加入50 μL，孵育30 min，超纯水洗去未聚合的反应物，200 μL洗脱液孵化，洗去模板病毒，超纯水水洗去残留洗脱液；

3）印迹膜的识别目标病毒：取一定浓度范围的目标流感病毒入到步骤（2）得到的96孔酶标板的板孔中，每孔加入30 μL，孵育60 min，超纯水洗去未吸附的目标病毒；

4）HRP标记于固载在印迹膜上流感病毒的表面：吸附了目标病毒的96孔酶标板中加入50 μL一定浓度HRP溶液，轻轻的震动，室温孵化，超纯水洗去未吸附的HRP；

5）光化学反应：新鲜配制一定浓度的 H₂O₂溶液和OPDA避光保存，二者等体积混合，向步骤（4）获得的96孔酶标板中每孔加入100 μL，避光37℃恒温一定时间，测定荧光强度，激发波长为468 nm，最大发射波长567 nm 处的荧光强度作为定量分析的依据。

3.根据权利要求1所述的96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器，其特征在于：步骤1）中的流感病毒浓度为20~50 μg/mL，步骤1）中的模板分子是流感病毒H1N1,H3N2, H5N1中的一种，或者是刀豆蛋白、植物血球凝集素中的一种。

4.根据权利要求1所述的96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器，其特征在于：其特征在于：步骤2）中的洗脱液为10% HAc（v/v）,10% SDS（w/v）,10% HAc（v/v）和1% SDS（w/v）的混合液，1 mol/L NaCl中的一种，洗脱液孵化时间为20 ~120 min。

5.根据权利要求1所述的96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器，其特征在于：步骤3）中的流感病毒浓度为0.01~1.0 μg/mL。

6.根据权利要求1所述的96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器，其特征在于：步骤4）中的HRP浓度为0.01~0.1 mg/mL, HRP室温孵化时间20 ~80 min。

7.根据权利要求1所述的96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器，其特征在于：步骤5）中的H₂O₂浓度为0.5~2.0 mmol/L, OPDA 浓度为0.5~2.0 mg/mL，两者要求新鲜配置，避光保存，保存时间不超过2小时，37℃恒温时间为5 ~20 min。

8.一种如权利要求1所述的96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器在血清样品中流感病毒的检测应用，其特征在于：具体步骤为：于稀释20倍的胎牛血清溶液中，添加一定浓度的流感病毒，使流感病毒终浓度为1.0 μg/mL，加入到96孔酶标板的分子印迹膜上，孵化60 min，进行HRP标记和光化学反应及荧光检测，并计算添加回收率。

9.根据权利要求1所述的96孔酶标板固载的流感病毒印迹荧光传感器的应用，其特征在于：所述流感病毒添加浓度为0.05~1.0 μg/mL，回收率在70~110%之间。