[发明专利]基于微流控芯片检测多种病原体的试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一种基于微流控芯片检测多种病原体的试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的引物及Taqman荧光探针。本发明的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用Taqman探针荧光PCR技术，针对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌进行检测，设计引物和探针的序列在肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒及其使用方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,CP)和嗜肺军团菌(Legionella pneumoniae,LP)感染是全球重要的感染性疾病，可在各年龄组儿童发病，以呼吸道感染最为常见，感染部位可贯穿整个呼吸道，且具有一定的传染性。MP、CP、LP是儿童急性上呼吸道感染常见的致病菌，也是引起社区获得性肺炎的主要病原菌。三种病原菌引起的肺炎支原体肺炎、肺炎衣原体肺炎和嗜肺军团菌肺炎为非典型肺炎，在症状、体征及辅助检查方面无特异性，病原体检测有局限性，易于误诊，利用分子技术可以快速、准确地进行诊断，从而配合正确的治疗，减少抗菌药物的滥用。由这三种病原体引起的呼吸道感染所占比重较高，且三者的混合感染也日渐增多，同时检测、快速检测三种病原体的产品越来越有需求。利用多重荧光PCR分子诊断技术可以达到对三种病原体的快速同步检测，对临床早期诊断有着非常重要的意义。

肺炎支原体是无细胞壁，介于病毒和细菌之间能自我复制进行独立生活的最小微生物，革兰氏染色阴性。MP可以引起支原体肺炎、上呼吸道感染、支气管炎、肺脓疡、免疫性溶血性贫血、脑膜脑炎、心肌炎、心包炎、肾炎、社区获得性肺炎等疾病。MP有很强的传染性，主要由口、鼻分泌物以气溶胶微粒的形式通过呼吸道传播，其潜伏期较长，存在全年散发、秋冬季高发的特点，会小范围内流行，引起集体感染，如幼儿园、学校、家庭成员交叉感染等。文献报道的阳性检出率达到15％～35％，另外，15％～20％社区获得性肺炎是由肺炎支原体引起的，在儿童社区获得性肺炎中更是占到20％左右。

肺炎衣原体是介于病毒与细菌之间的专属细胞内寄生的病原体，在宿主细胞内生长、繁殖和形成包涵体。传染途径与MP一样是通过呼吸道分泌物在人-人之间传播，在半封闭环境可存在小范围流行。根据遗传学和生物学分为TWAR、考拉和马3个生物变种，代表株为TW-183T(ATCC VR 2282T)，是一种常见的人类呼吸道致病菌。CP可以引起急性呼吸道感染如咽炎、喉炎、鼻窦炎中耳炎、支气管炎及肺炎等，以肺炎最常见，支气管炎次之；还可以引起心肌炎、心内膜炎、动脉硬化和冠心病、虹膜炎、肝炎、脑膜炎和关节炎等疾病。潜伏期约为10天，一年四季均可感染，其流行可呈散发性或爆发性传播，尤其在空间相对封闭、人群聚集较多、空气不太流通的公共场所，文献报道的阳性检出率5％～20％。目前的诊断主要靠病原体的分离和血清学抗体的检测，但时间长、操作复杂，而荧光PCR检测可用于急性感染诊断及特殊人群流行病学研究。