[发明专利]一种呼吸道感染病原检测用引物组、快速诊断试剂盒及检测方法在审
| 申请号： | 201711477040.5 | 申请日： | 2017-12-29 |
| 公开（公告）号： | CN108300803A | 公开（公告）日： | 2018-07-20 |
| 发明（设计）人： | 张睿;李博安;詹尔昌;郭永斌 | 申请（专利权）人： | 博迪泰（厦门）生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 郭锦辉 |
| 地址： | 361000 福建省厦门*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 病原 呼吸道感染 引物组 检测 快速诊断试剂盒 病原检测 副流行性感冒病毒 分子生物学领域 呼吸道合胞病毒 流行性感冒病毒 嗜肺军团杆菌 肺炎衣原体 肺炎支原体 多重感染 基因扩增 扩增效率 特异性强 一次检测 鼻病毒 多重化 聚合酶 腺病毒 重组酶 呼吸道 | ||
【说明书】：
本发明涉及一种呼吸道感染病原检测用引物组、快速诊断试剂盒及检测方法，属于分子生物学领域。所述引物组可以一次检测包括A型流行性感冒病毒、B型流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒、副流行性感冒病毒1、2、3型、腺病毒、肺炎支原体、嗜肺军团杆菌、肺炎衣原体及鼻病毒在内的9种呼吸道感染病原。本发明采用固相重组酶聚合酶恒温基因扩增法检测呼吸道多重感染病原。采用本发明的引物组检测呼吸道感染病原特异性强、扩增效率高，可有效、快速地对所述9种病原同时进行检测，实现了多重化检测。
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种呼吸道感染病原检测用引物组、快速诊断试剂盒及检测方法。
背景技术
急性呼吸道感染常见的疾病有急性上呼吸道感染、急性气管—支气管炎、支气管肺炎、支气管扩张等，感染人群以儿童多见，是世界范围内低龄儿童(<5岁)死亡的首位原因，每年可造成约5百万儿童死亡。世界卫生组织不久前发布的统计结果显示，世界十大死因中呼吸道感染，以5.9％的发病率，仅次于冠心病和中风，位居第三位，位列第四位的慢性阻塞性肺病(5.4％)的死亡也多与感染有关。引起呼吸道感染的病原体种类繁多，主要包括A型流行性感冒病毒(Influenza A virus,FluA)、B型流行性感冒病毒(Influenza Bvirus,FluB)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)、副流行性感冒病毒1、2、3型(Parainfluenza Virus type I,II,III,PIV)、腺病毒(Adenovirus,AD)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)、嗜肺军团杆菌(Legionella pneumonia,LP)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,CP)及鼻病毒(Human Rhinovirus,HRV)等。一种病原体可引起多种临床表现，同一临床表现又可由多种病原体引起。临床中往往很难针对病原体进行治疗，容易造成某些患者长期发热、甚至病情加重以及滥用抗生素。对于儿童患者，在发病初期如果不能立即确诊，往往导致病情突然恶化。因此呼吸道感染的病原体快速检测，对临床及时诊断和疫情报告均有重要意义。
目前检测呼吸道急性感染常用的方法有：病原体的分离培养及组织细胞培养法、血清学、直接检测法(包括电镜法)、间接和直接免疫荧光抗体法(IFA/DFA)、酶免疫测定(EIA)、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标(AP-PAAP)法、荧光定量PCR法等。其中，九项呼吸道感染病原体IgM抗体免疫学检测试剂(间接免疫荧光法)以及荧光定量PCR法为目前较为常用的两种方法。呼吸道感染病原体IgM抗体免疫学检测法具有直观、技术成熟的优点，但费时、操作繁琐、灵敏度低、假阳性高限制了其在临床上的参考价值。随着现代分子生物学的发展,出现了很多快速特异的方法，如针对核酸的荧光定量PCR技术，具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点。但荧光定量PCR技术动辄30-40万的昂贵仪器以及要求有严格的实验室环境和训练有素的操作人员，都及大地限制了该技术在大型医疗机构之外场所的开展。
基于重组酶-多聚酶的核酸检测技术(Recombinase-polymerase amplification,RPA)模拟了细胞内核酸合成机制，在恒定温度范围内，藉由重组酶、多聚酶及单链结合蛋白使DNA双链解旋，并促使特异性DNA片段扩增，以达到核酸体外扩增的效果。整个过程迅速(10-20分钟)且于低恒温(37-42℃)进行。
然而在多重检测，特别是中通量检测领域，恒温核酸扩增技术包括RPA技术一直发展缓慢。受制于标记用荧光染料的光谱特性和荧光检测通道数量，国内外目前的RPA技术在多重呼吸道感染病原检测方面还无成熟技术。
因此，需要一种能够快速、简易、无须贵重仪器、可同时进行呼吸道感染病原多核酸目标的检测试剂盒及检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种基于固相恒温基因扩增技术的呼吸道感染病原检测用引物组。
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- 张玉宝;王亚军;谢忠奎;王若愚;郭志鸿;杨果;邱阳 - 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所;徐州沐阳生物科技发展有限公司
- 2016-04-07 - 2019-10-25 - C12Q1/70
- 本发明提供了一种免疫捕获三重RT‑PCR同步检测百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的方法，其步骤包括在同一个PCR反应管中用LSV、LMoV和CMV的多克隆抗体特异性捕获LSV、LMoV和CMV粒子、利用LSV、LMoV和CMV的特异性引物进行三重反转录聚合酶链式反应RT‑PCR、琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；该方法将ELISA和RT‑PCR结合，对现有的免疫捕获RT‑PCR进行了改进，实现了用免疫捕获RT‑PCR同步检测三种百合病毒LSV、LMoV和CMV，从而完善了免疫捕获RT‑PCR技术。
- 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用-201910191679.X
- 刘万里;邓敏;邢珊 - 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）
- 2019-03-14 - 2019-10-25 - C12Q1/70
- 本发明提供一种基于CRISPR‑Cas12a和G四链体‑血红素的HBV的检测方法及应用，过程如下：以HBV患者血清中提取到的DNA为模板，将含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH2O的RPA反应体系加入冻干酶粉中，再加入MgAc混匀，孵育，得到RPA产物；PS2.M DNA溶解在Tris‑HCL溶液，向溶液中加入Hemin溶液，制得PS2.M/Hemin溶液；将FnCas12a和HBV crRNA加入到Tris‑HCl缓冲液中，孵育，制得Cas12a/crRNA复合物溶液；将RPA产物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA复合物溶液孵育，加入ABTS和H2O2处理后测定吸光度。本发明是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性和设备简单的检测方法。
- 一种用于检测黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物及其应用-201910525050.4
- 严佳文;解璞;袁启凤;马玉华;王立娟;陈楠 - 贵州省果树科学研究所
- 2019-06-18 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明提供了一种用于检测黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物，所述引物中一对是鉴定黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物CMV‑657F和CMV‑657R，另一对是用于黄瓜花叶病毒西番莲分离物的实时荧光定量RT‑PCR的引物CMV‑174F和CMV‑174R，还提供了应用，用于黄瓜花叶病毒西番莲分离物的定量检测。本发明结合两对引物的定量检测方法灵敏度高、特异性强、检测结果准确，用于西番莲脱毒苗和田间感病植株的早期鉴定和病毒含量定量分析，为西番莲无病毒良种苗木繁育及推广提供技术支撑。该方法能够在4～5小时对样品中的黄瓜花叶病毒西番莲分离物进行准确定量，不仅节约了时间、简化了实验步骤，还有利于在植物发病之前采取相应的补救措施，防止该病毒在作物间广泛传播所带来的巨大经济损失。
- SVA、FMDV、SVDV和VSV的一步法多重实时荧光定量PCR检测引物和探针-201910672178.3
- 王秀明;陈君彦;王玉雯;武瑾贤;魏学峰;刘国英;关平原;范秀丽;张贵刚;王艳杰;刘建奇 - 金宇保灵生物药品有限公司
- 2019-07-24 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种SVA、FMDV、SVDV和VSV的一步法多重实时荧光定量PCR检测引物和探针，属于生物技术检测领域。并基于提供的引物和探针开发出了用于同时检测SVA、FMDV、SVDV和VSV的试剂盒。本发明提供的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好，可以实现对SVA、FMDV、SVDV和VSV同时准确定性和定量检测，将在SVA、FMDV、SVDV和VSV的检测及疫苗生产、例如疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗中发挥重要作用，应用前景广阔。
- 用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用-201910677694.5
- 卢孟孟;胖铁良;王文轩;马蒙蒙;孙晋华;李建中 - 廊坊诺道中科医学检验实验室有限公司
- 2019-07-25 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种用于检测呼吸道病毒的引物探针组合，包括16对引物及对应的16条探针。本发明还提供了用于检测呼吸道病毒的试剂盒，包括用于检测呼吸道病毒的引物探针组合。本发明还提供了用于检测呼吸道病毒的试剂盒在检测或辅助检测呼吸道病毒中的非诊断目的的应用。应用本发明提供的用于检测呼吸道病毒的试剂盒能同时检测16种呼吸道病毒，实现多重检测，灵敏度高，快捷方便，可实现对样本进行批量检测。
- 新型鹅星状病毒SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂盒-201910700274.4
- 李宁;刘思当;蔡玉梅;杨玉栋;姜胜男;赵君 - 山东农业大学
- 2019-07-31 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种新型鹅星状病毒荧光定量PCR检测试剂盒。所述荧光定量PCR检测试剂盒中含有SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示的引物对，以及标准品质粒和荧光定量PCR反应试剂。本发明的荧光定量PCR试剂盒可以对新型鹅星状病毒进行检测，该试剂盒的特异性强，只与新型鹅星状病毒特异性结合，与其他鹅源病毒都没有交叉反应；而且检测的灵敏度高，在标准品为1×101‑1×107拷贝范围内都有极好的线性关系，可以高效检测新型鹅星状病毒病鹅组织以及无临床症状的病毒携带鹅，提高了检测效率。
- 非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒-201910773232.3
- 赵林萍;娄亚坤;杨楠;付燕峰;梁小红;任宝红;崔兴涛;曾小宇 - 郑州中道生物技术有限公司;河南中标检测服务有限公司;郑州大学
- 2019-08-21 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒，包括特异性引物ASFV‑F和ASFV‑R，以及RAA‑exo探针ASFV‑P，用四氢呋喃(THF残基)，dT‑荧光团和dT‑淬灭团取代靶标扩增子序列内的碱基，标记的报告荧光染料为FAM，荧光淬灭基团为BHQ‑1，试剂中的核酸外切酶可在THF位点裂解探针，从而分离荧光基团和淬灭基团并产生荧光信号。本发明提供的试剂盒可在37～42℃恒温条件下，20min内实现非洲猪瘟病毒的检测，特异性为100％，检测敏感性为10copies/μl。因此，本发明的试剂盒具有操作简单、快速、灵敏的特点，为非洲猪瘟病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段。
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