[发明专利]两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因及其引物和应用

说明书

本发明公开了两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因及其引物和应用。本发明通过从本实验转录组数据以及前人研究的内参基因中筛选出表达较为稳定的13个候选基因，通过geNorm软件对其稳定性进行评估，分析出SKD1与YLS8是两种树形梨叶片在不同发育时期中表达最稳定的一对内参基因组合。本发明提供的内参基因组合能为梨相关功能基因的精确定量提供有力支持，因而具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因及其引物和应用。

背景技术

梨是世界上极具重要经济价值的落叶果树，良好的整形模式是获得优质果品的重要栽培基础。树形结构可以调节冠层微气候(光照、温度、湿度和其他环境因子)，从而影响光合产物积累和病虫发生率。明确不同树形的结构优点，利用其促进光合产物积累和果实品质提高，一直是梨栽培研究的热点和重点。

梨树是顶端优势明显的树种，树体高大，枝条干性较强。传统的栽培方式为无架树形结构，其主要包括疏散分层形、开心形等。我国上世纪九十年代初开始引进棚架栽培，并在生产实践上不断发展和完善。棚架栽培模式最明显的特征是无中心干，直立枝条被绑缚到架面上，不仅具有通风透光的效果，而且解除了顶端优势，促进花芽分化和果实座果。然而不同树形结构是如何影响梨光合作用相关基因的表达，其分子解析还有待进一步探明。

由于实时定量PCR技术(qRT-PCR)具有精确性高、灵敏度性强和可重复性等特点，目前已成为最为广泛定量基因表达的分子生物学方法。然而qRT-PCR数据的准确性极大的依赖于所选内参基因的稳定性，因此，筛选稳定表达的内参基因成为精确定量目标基因表达量的前提。广泛的研究报道表明常用的内参基因在不同的实验条件下会出现表达不稳定的情况，这很可能导致目的基因检测结果准确性降低。目前没有任何一种内参基因在所有的实验条件下恒定表达。因此，筛选出研究实验条件下最适合的内参基因对目标基因的准确定量至关重要。同时，当评估样本量比较大时，往往单一的内参基因不能准确的进行矫正和标准化，选用多内参组合相对单一内参基因会更为准确。

发明内容

本发明目的是开发一种适合用于梨叶组织在两种树形(棚架树形和疏散分层形)不同发育时期(5月、6月、7月和8月)中的内参基因及其特异性引物，为实现相关功能基因精确定量提供可靠保证；克服了现有技术利用传统单一的内参基因导致不能对目的基因进行准确标准化，进而出现检测结果准确性降低甚至出现错误的问题。

本发明的第一个目的是提供两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因。所述的两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因，其特征在于，为内参基因SKD1和YLS8，所述的内参基因SKD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述的内参基因YLS8的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。

本发明的第二个目的是提供上述两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因的特异性引物。所述的两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因的特异性引物，其特征在于，所述的内参基因SKD1的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQID NO.15和SEQ ID NO.16所示；所述的内参基因YLS8的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。

本发明的第三个目的是提供所述的内参基因或所述的特异性引物在制备荧光定量试剂盒中的应用。

优选，所述的试剂盒还包括常规PCR试剂。

所述的内参基因SKD1和YLS8作为两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因的应用，所述的内参基因SKD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述的内参基因YLS8的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。