[发明专利]一种双荧光报告重组质粒载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种双荧光报告重组质粒载体，其特征在于，含有编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列和miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列。

2.如权利要求1所述的双荧光报告重组质粒载体，其特征在于，所述编码的绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因在双向的转录响应原件启动子(Transcriptional response element，TRE)的控制下表达。

3.如权利要求1或2所述的双荧光报告重组质粒载体，其特征在于，所述编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列以及miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列被放置在两个表达读码框内，所述编码的绿色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、绿色荧光蛋白、和miRNA特异靶基因3’非翻译区序列下游的第一polyA加尾信号；所述编码的红色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、红色荧光蛋白、和miRNA特异靶基因3’非翻译区序列下游的第二polyA加尾信号。

4.如权利要求2所述的双荧光报告重组质粒载体，其特征在于，所述的双向转录响应原件启动子的激活受强力霉素的调控。

5.权利要求1至4其中任一所述的双荧光报告重组质粒载体的构建方法，其特征在于，依次按以下步骤进行：

(1)用PCR方法扩增绿色荧光蛋白基因；

(2)将步骤(1)扩增的绿色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体pTRE3G-BI启动子的3’方向上，获得重组质粒载体pTRE3G-GFP，并进行测序分析，将验证正确后的重组质粒载体用于下一步的连接；

(3)用PCR方法扩增红色荧光蛋白基因；

(4)将步骤(3)扩增的红色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体pTRE3G-GFP启动子的5’方向上，获得重组质粒载体pTRE3G-GFP-mCherry，并进行测序分析，将验证正确后的重组质粒载体用于下一步的连接；

(5)用PCR方法扩增miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列插入到质粒载体pTRE3G-GFP-mCherry的mCherry 3’方向上，将验证正确后的重组质粒载体命名为pTRE3G-GFP-mCherry-3UTR。

6.权利要求1至4其中任一所述的双荧光报告重组质粒载体用于验证miRNA是否结合其特异靶基因的3’非翻译区的应用。