[发明专利]检测人Legumain的ELISA检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了检测人Legumain的ELISA检测试剂盒及其应用。本发明所提供的检测人Legumain的ELISA检测试剂盒，包括包被捕获抗体的酶标板、封闭液、洗涤液、生物素标记的检测抗体、酶标生物素、底物显色液、终止液；所述捕获抗体是由名称为LGMN‑1，保藏号为CGMCC NO.12994的杂交瘤细胞株分泌产生；所述检测抗体是由名称为LGMN‑2，保藏号为CGMCC NO.12995的杂交瘤细胞株分泌产生。本发明填补了人Legumain定量检测的空白，它以双抗体酶联免疫反应为测定基点，具有灵敏度高，特异性好，重复性高和检测准确快速的优点。

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及检测人Legumain的ELISA检测试剂盒及其应用。

背景技术

乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家，但是今年我国乳腺癌的发病率的增长速度却高出高发国家1～2个百分点。乳腺癌已经成为当前社会的重大公共卫生问题，早发现，早治疗可以极大地提高乳腺癌的存活率。

Legumain(C13)(EC 3.4.22.34)又称天冬酰胺内肽酶(asparaginyl endopep-tidase，AEP)，是一种溶酶半胱氨酸蛋白酶，是半胱氨酸蛋白酶C13家族一个新成员。人的Legumain基因定位于14号染色体，编码由433个氨基酸残基组成的多肽链,去糖基化后成为具有生物活性的成熟酶，与小鼠具有83％的同源性。人的legumain蛋白具有3种形式，分别为56kD的酶原前体，46kD和36kD成熟酶。Legumain的活性催化中心是由组氨酸(His)和半胱氨酸(Cys)组成的催化二联体，是Legumain发挥催化活性所必需的，也是每一个C13家族成员必有的结构。

与正常组织相比，Legumain在小鼠和人类多种实体瘤组织中高表达，尤其是在肿瘤细胞、新生血管内皮细胞和肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophages，TAMs)中，而在体外培养的相应肿瘤细胞株中却不表达。Liu等最先报道Legumain与肿瘤发生发展有关。他们通过Western blot和免疫组化分析，发现在多种鼠肿瘤细胞中，Legumain表达增高，而在体外培养的各肿瘤细胞株中则不表达。Liu等还检测了人正常组织及多种实体瘤组织，结果显示在正常组织中，Legumain表达极低，而在多种实体瘤组织中(如乳腺、结肠、肺、前列腺、卵巢肿瘤和中枢神经系统恶性肿瘤)Legumain高表达。

侵袭和转移是恶性肿瘤的播散方式，也是影响肿瘤患者的治疗效果和预后的重要因素。Legumain与整合素形成复合物，在实体肿瘤的低氧和酸性微环境中，具有激活肿瘤细胞Pro-MMP2和Pro-Cathepsin L的功能，促进肿瘤生长、侵袭和转移。为了证实Legumain的表达是否与肿瘤的分化程度、坏死、凋亡及预后相关。Murthy等通过Western blot和免疫组织化学方法，对164例原发性结肠癌、34例远端正常粘膜组织、89例癌旁组织及33例淋巴结转移癌组织样本进行临床病理检测，结果表明，在原发性结肠癌中，Legumain表达明显高于远端正常组织和癌旁组织(P<0.05)，但与淋巴结转移癌组织样本无显著差异(P>0.05)。同时，Legumain在肿瘤患者瘤体(P＝0.01)或基质中的表达(P＝0.04)水平较低时，其预后较好。Gawenda等、通过免疫组织化学方法研究了432例乳腺浸润癌和128例乳腺非癌组织样本，证实人乳腺癌组织中Legumain高表达，并且与乳腺癌临床病理变化有一定的相关性。Lin(Lin et.al.,JNCI,2014.)等报道了乳腺癌病人细胞内的Legumain在TRAF6的催化下进行泛素化，然后与HSP90α形成复合体被运输到细胞外随血液循环系统到达远端组织，在远端组织进行活化后促进肿瘤的迁移和扩散，并且已证实乳腺癌病人血清中Legumain的水平与癌症的发展阶段呈一定的相关性。血清中的Legumain水平可以促进肿瘤的侵袭和扩散，用抑制剂或者抗体阻断血清中的Legumain作用可以消除小鼠体内肿瘤的扩散。