[发明专利]辣椒和番茄细菌性疮痂病菌MLST分子分型方法

说明书

本发明公开了一种辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分子分型的方法，首次公开了采用多位点序列分型方法（MLST），对辣椒和番茄细菌性疮痂病菌进行分子分型的操作技术，本发明提取该病原菌基因组DNA，通过7个看家基因筛选、扩增、检测与测序。采用DNAMAN软件对测序结果进行多序列比对与分析，获得菌株序列型（ST）。在线采用eBURST V3程序进行序列型分析，可将4种病原菌有效区分。本分型技术所使用的7个看家基因组合、扩增引物均为首次采用，PCR反应体系和条件为自行优化。该技术流程可以用于辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分类鉴定和遗传多样性研究。

技术领域

本发明涉及植物病原菌分子分型技术，具体涉及用多位点序列分型(MLST) 技术对辣椒和番茄细菌性疮痂病菌（Bacterial Spot caused by Xanthomonads）进行分型的方法。

背景技术

辣椒和番茄疮痂病是普遍发生在茄科植物上的一种细菌性病害，该病菌主要危害辣椒和番茄的叶片、茎蔓、果实，尤以叶片上发生普遍。叶片发病初期形成水渍状、黄绿色的小斑点，扩大后变成圆形或不规则形、暗褐色、边缘隆起而中央凹陷的病斑，粗糙呈疮痂状。严重时叶片发黄、干枯、破裂，早期脱落。茎部和果梗发病，初期形成水渍状斑点，逐渐发展成褐色短条斑。病斑木栓化隆起，纵裂呈溃疡状疮痂斑。果实发病，形成圆形或长圆形的黑色疮痂斑。该病害如果防治不及时，不仅大幅降低辣椒和番茄的产量，而且还严重影响辣椒和番茄的果实品质，造成重大经济损失。

目前该病菌已在美国、巴西、澳大利亚、南非、南斯拉夫、墨西哥、哥斯达黎加、阿根廷等全球60多个国家和地区发生，是世界性病害之一。在我国新疆、甘肃、内蒙古、黑龙江、北京、山西等十几个地区也有发生，已引起人们广泛的关注。早在20世纪60年代，Dye等（1964）就已经发现辣椒和番茄细菌性疮痂病病原菌存在相当丰富的遗传多样性。2004年Jones等将该病菌分成4个种：X. euvesicatoria、X. vesicatoria、X. perforans 、X. gardneri。

多位点序列分型(MLST)技术是直接利用5~10个看家基因的核苷酸序列片段之间的碱基差异进行分子分型的方法。看家基因是有保守代谢功能的基因，进化相对缓慢，通过序列中碱基的变化可反映菌株之间的遗传关系和进化关系。在MLST结果分析中，每个单一的核苷酸差异即可视为一个新的等位基因(allele)，把每个来自于同一看家基因的不同等位基因用阿拉伯数字编号，由此使得每个菌株中看家基因的等位基因都有相应的编号，最终可得到该菌株的由一串数字组成的等位基因号码，即该菌株的序列型(Sequence Type,ST)。将不同菌株的序列型结果采用eBURST程序进行分析，则占核心或中心地位的ST表示是普遍的，而分支ST则是由该核心ST衍生出的亲缘STs，这些亲缘STs在遗传学上称为同源复合体(Clonal Complexes, CC)。通过MLST分型不仅可以判断菌株之间的亲缘关系，而且还可以推断它们是否有共同祖先，因此MLST技术被广泛地用于细菌病原菌的分类中。此外，多位点序列分型技术也可用于病原菌株遗传多样性和分子进化研究，构建系统发育树。由于该方法分辨率高，并克服了其他方法存在的不同实验室或实验室内部的结果可比性及重复性较差的缺陷，所以相关数据结果可通过网络实现数据共享和对比。目前，辣椒和番茄细菌性疮痂病菌的多位点序列分型方面的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是建立辣椒和番茄细菌性疮痂病菌的多位点序列分型技术体系，用于辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分类鉴定和遗传多样性研究，所要解决的关键问题是该方法所使用的看家基因筛选确定、引物的设计、PCR反应体系和条件的确定。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分子分型方法，该方法筛选7个看家基因，并设计引物，采用优化的PCR反应体系和条件进行扩增，用DNAMAN软件对测序结果进行多序列比对与分析，获得各个菌株序列型(ST)，在线采用eBURSTV3程序进行序列型分析，可将4种病原菌有效区分。