[发明专利]一种高转化效率大肠杆菌热激感受态细胞制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域对大肠杆菌热激感受态细胞的培养及制备方法，特别是 涉及对大肠杆菌菌株DH5α的培养及制备方法，尤其是涉及一项显著提高大肠杆菌菌株热激 转化效率和稳定性的关键技术。

背景技术

大肠杆菌热激转化技术是基因工程和分子生物学研究的基础，在DNA片段测序、功 能载体构建和质粒扩繁等方面广泛使用。转化效率对于注重克隆数量试验来说（如文库构 建等），一直是个技术瓶颈。截至目前，除市售的大肠杆菌热激感受态细胞外，实验室自制的 感受态细胞转化效率参差不齐。也有科研机构采用电击转化代替热激转化，以提高转化效 率，但此方法需要特殊仪器设备即电转仪，试验条件要求苛刻，同时电击感受态细胞比热激 感受态细胞价格上要贵数倍。在国家大力提倡节约的大环境下，如何减少不必要的科研专 用材料费用支出，显得尤为重要。相比之下，大肠杆菌热激感受态细胞因其无需特殊设备、 制备方法简单而备受科研人员青睐，其转化原理是利用大肠杆菌处于0℃的氯化钙低渗溶 液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的外源DNA形成抗DNase的羟 基-磷酸钙复合物，附着在细胞表面，经42℃短时间热激处理，细菌细胞能吸收外源DNA复 合物，通过在相应培养基上复苏并分裂增殖，从而实现外源DNA的大量复制。然而目前尚无 一个稳定、高效的大肠杆菌热激感受态细胞制备技术。经过本课题组多年的探索，在高转化 效率大肠杆菌热激感受态细胞制备方面取得一定进展，并已成功应用在DNA测序载体、基因 功能分析载体等转化方面，取得了理想的转化效率。无论是哪种大肠杆菌菌株，常规方法是 先将大肠杆菌菌种在固体平板上复苏，过夜培养后挑单菌落在液体培养基中进行少量及后 续的大量培养，随后采用氯化钙溶液在4℃条件下进行菌体漂洗，并保存于含10%甘油的氯 化钙保存液中，置-80℃长期保存。利用这种制备方案得到的大肠杆菌热激感受态细胞转 化效率十分不稳定，且不同批次、不同制备方法得到的热激感受态细胞转化效率也不同，同 时操作人员的熟练程度也影响制备的感受态细胞最终转化效率。转化效率是评价感受态细 胞优劣的核心标准。通过改进大肠杆菌细胞培养、漂洗环节及菌保存液成分，进一步提高制 备的大肠杆菌热激感受态细胞转化效率及稳定性，对于加快基因工程和分子生物学研究进 程具有重要意义。

发明内容

本发明目的是提供一项从大肠杆菌菌株制备高转化效率和稳定的热激感受态细 胞的关键技术，作为分子生物学试验基础，为基因工程及功能基因组学研究提供技术支撑， 减少不必要的科研专用材料费用支出，提高科研工作效率。