[发明专利]苏氨酸脱氨酶、编码基因、载体、工程菌及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及苏氨酸酶基因、载体，和产苏氨酸脱氨酶基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程领域。

(二)技术背景

苏氨酸脱氨酶(Threoninedeaminase，简称TD，EC4.3.1.19)，又称苏氨酸脱水酶，是生物体内氨基酸代谢的重要酶类，能够催化L-苏氨酸或L-丝氨酸脱氨生成α-丁酮酸或丙酮酸，尤其是在生物催化生产α-丁酮酸的工艺中具有关键的作用。α-丁酮酸是一种是生产L-2-氨基丁酸、L-异亮氨酸、正丙醇、D-2-羟基丁酸以及食品配料的重要原材料，尤其是L-2-氨基丁酸，作为抗癫痫药物左乙拉西坦和抗结核药物盐酸乙胺丁醇的重要前体，受到广泛的关注。

目前已经有一些苏氨酸脱氨酶的报道，例如来自于施氏假单胞菌PseudomonasstutzeriSDM的苏氨酸脱氨酶，其最高的底物浓度为30g/L。然而，这些苏氨酸脱氨酶对高底物浓度的耐受能力较弱，大大限制了其在工业生产中的应用。因此筛选出新型的表达耐高底物浓度的苏氨酸脱氨酶基因，并通过基因工程技术构建高表达的基因工程菌在α-丁酮酸的制备中具有重要的意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种新的能够催化L-苏氨酸制备α-丁酮酸的苏氨酸脱氨酶，而且该酶具有更高的催化活力和底物耐受能力，更适用于工业化制备该中间体，解决了一般的苏氨酸脱氨酶最适底物浓度低的问题；应用该菌种生产苏氨酸脱氨酶具有产量高、工艺简单、便于工业化应用等优点，该菌株可以直接用于α-丁酮酸的生产，而不需细胞破碎。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的苏氨酸脱水酶(记为EcTD)，所述苏氨酸脱水酶的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示。

1MADSQPLSGAPEGAEYLRAVLRAPVYEAAQVTPLQKMEKLSSRLDNVILVKREDRQPVHS

61FKLRGAYAMMAGLTEEQKAHGVITASAGNHAQGVAFSSARLGVKALIVMPTATADIKVDA

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任何对SEQIDNO：1所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要其与SEQIDNO：1所示氨基酸序列具有95％以上同源性，均属于本发明的保护范围。

进一步，为实现EcTD在大肠杆菌等原核生物中的可溶性异源表达，通过基因工程常规操作，以全合成的方法获得了对应于所述SEQIDNO：1氨基酸序列的该苏氨酸脱氨酶的核苷酸序列，如SEQIDNO：2所示。

1ATGGCGGACTCTCAGCCGCTGTCTGGCGCACCGGAAGGTGCTGAATACCTGCGTGCTGTA

61CTGCGTGCTCCGGTGTACGAAGCCGCCCAGGTGACGCCGCTGCAGAAGATGGAAAAACTG

121TCTTCCCGTCTGGATAATGTGATTCTGGTGAAACGTGAGGATCGTCAGCCGGTACACAGC

181TTCAAACTGCGTGGTGCCTACGCAATGATGGCTGGTCTGACCGAAGAACAGAAAGCACAC

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