[发明专利]一种肝癌干细胞的无血清培养基及其培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生物细胞培养技术领域，具体涉及一种肝癌干细胞的无血清培养基及其培养方法。

背景技术

近年来肿瘤干细胞的理论研究已受到广泛关注，被认为是最主流的原因。Michor等认为干细胞是一类在原来的细胞中具有自我更新、无限增殖，多向分化的一部分极小群的细胞（HwangHI,LeeTH,JangYJ.Cellproliferation-inducingprotein52/Mitofilinisasurfaceantigenonundifferentiatedhumandentalpulpstemcells[J].StemCellsDev,2015）。然而在肿瘤细胞中也存在着肿瘤干细胞（cancerstemcells，CSC），并在成瘤潜能上具有强大的自我更新和无限增殖能力，也在肿瘤的发生、发展、转移及侵袭、复发中也同样起到至关重要的作用。

越来越多的人所认同肿瘤干细胞的存在，干细胞数量存在太少，不易分离，因此后续实验的开展比较困难。如何使其在体外有效的分离、培养，扩增，并以此为研究对象是我们思考的方向。在长期研究中，发现加入FGF和EGF的无血清培养液，使正常成体干细胞的体外扩增，并维持多向分化潜能。目前已经在乳腺癌、结肠癌、恶性神经系统肿瘤等实体瘤中分离培养得到了类似肿瘤干细胞的一群细胞。我们将以此为基础进行了肝癌干细胞的相关培养。

本发明采用直接无血清培养的方法，使得肝癌细胞可以成球并连续稳定传代，其用相关肝癌干细胞标志物的分选发现，从成球的肝癌细胞株中分离出较常规贴壁培养所得到的肝癌干样细胞量明显较多。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种肝癌干细胞的无血清培养基及其制备方法，用于肝癌细胞的培养，且该培养方法获得的肝癌干细胞具有自我更新能力、且富集。

一种肝癌干细胞的无血清培养基，以DMEM／F12+GlutaMAXTM-1培养基为基础，包括：人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子、无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液。

优选的，相对于DMEM／F12+GlutaMAXTM^-1基础培养基，人重组表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10的浓度为10-30ng/ml、胰岛素一号增长因子的浓度为10-30ng/ml、无血清补充营养成分的浓度为1-3%、肝素的浓度为40-60mg/ml、青霉素+链霉素双抗溶液的浓度90-110U/ml。

所述的，DMEM／F12+GlutaMAXTM^-1基础培养基、人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子、无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液均可从市面公司购买得到。

优选的，EGF的最优浓度为20ng/ml、FGF-10的最优浓度为20ng/ml、IGF-1的最优质量浓度为20ng/ml、B27的最优质量浓度为2%、肝素的最优质量浓度为50mg/ml、青霉素+链霉素双抗溶液的最优浓度为100U/ml，浓度均相对于DMEM／F12+GlutaMAXTM^-1培养基而言。

本发明还为肝癌干细胞的研究提供了丰富的实验材料。提供一种肝癌干细胞的无血清培养基的培养方法，包括以下几个步骤：

步骤A:培养基制备：在无菌超净工作台中将重组表皮生长因子EGF、人重组碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素一号增长因子，无血清补充营养成分B27、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液添加至DMEM／F12+GlutaMAXTM^-1培养基中，吹打混匀;

步骤B:复苏人肝癌细胞系：将细胞从液氮罐中取出后，水浴箱振荡使其充分均匀受热后快速融化；在超净工作台中，加入含质量浓度为10%FBS的高糖DMEM完全培养基,和冻存管中的DMSO混合，离心弃掉上清;再用含质量浓度为10%FBS高糖DMEM完全培养基重悬细胞，吹打混匀，于透气培养瓶中培养;

步骤C:肝癌细胞用含含质量浓度为10%FBS的DMEM高糖培养基进行常规培养，贴壁长至80%-90%时传代；吸去培养瓶中的培养基，培养瓶中加入PBS清洗后，加入含质量浓度为0.25%胰蛋白酶+为0.01%EDTA消化液，倒置显微镜下观察，见贴壁细胞开始变圆、漂浮脱落即加入按消化酶体积和完全培养基体积1:3的体积的含质量浓度为10%FBS的高糖DMEM的完全培养基终止消化，离心弃上清；PBS洗涤细胞后再离心；