[发明专利]H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于PCR检测病毒技术领域，尤其涉及一种H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

禽流感(Avian influenza,AI)是危害禽类养殖的一类重要传染病，其病原体AIV为单股负链分节段的RNA病毒，其中血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)是两个比较重要的基因节段，Susan等的研究表明HA和NA基因之间存在某种平衡对病毒的致病性有很大关系。H3是目前已知的人类流行的主要亚型之一，血清学分析显示，从马等频繁分离到的H3N8亚型早在18世纪的人类中间流行，同时马可以通过实验感染H3N8亚型AIV这一事实，说明不应低估H3N8亚型AIV在自然界中的作用，应注意防止马、禽及人类H3亚型AIV的感染，对于H3N8亚型AIV的防控应予以高度重视。目前，针对AIV的检测方法为传统血清学试验，存在检测耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。

荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是，建立多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。目前，针对H3N8亚型AIV一步法实时荧光定量RT-PCR方法未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测并定量H3N8亚型禽流感病毒，为H3N8亚型AIV的监测提供技术支撑。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列。

H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。

探针A的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料ECLIPSE；探针B的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料ECLIPSE。

引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为3：3：3：2：2：2。

该试剂盒含有以下试剂：

A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B；

B液：AIV-H3+AIV-N8模板，作为阳性对照；

C液：ddH₂O，作为阴性对照。

A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.6μM，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.4μM。

针对目前缺乏对H3N8亚型AIV进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究筛选了两套特异性的探针和引物，并通过进行不同浓度的配比，获得最佳引物和探针的浓度组合，据此建立了H3N8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，本发明具有如下优点：

1)检测时间短

应用本发明可实现一管二检的目的，并且反转录和PCR一步完成，仅需约30分钟，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后还得花2小时进行凝胶电泳来观察结果；

2)检测敏感性高且特异性强