[发明专利]一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤1：由经过禁食采用静脉放血处死的试验鸡，无菌手术取2～3cm肠段置于含1％双抗的PBS中；

步骤2：制备肠壁组织浆液经离心去上清液后，于沉淀中加入0.05％胶原酶混合酶进行消化；

步骤3：向细胞液加入无血清RPMI-1640培养液终止消化，离心；去上清，无血清培养液重悬细胞，离心洗涤细胞；再次重悬细胞，分别经过不同目数自制细胞筛过滤细胞，离心去上清；

步骤4：将细胞重悬于密度为1.058g/mL淋巴细胞分离液中；于离心管底部加入4mL密度为1.098g/mL淋巴细胞分离液；将细胞悬液铺于之上，离心；取两个不同密度的淋巴细胞分离液界面黄白色细胞层；

步骤5：在浓度为1×10⁷/mL细胞悬液中，先后加入一定量的TCR1抗体和磁珠，进行磁珠二抗分选，并用PBS适当重悬稀释，保证二者与目标细胞结合；将细胞悬液置于细胞分选仪进样口，得到阳性细胞；

步骤6：将细胞悬浮于10％胎牛血清RPMI-1640培养液，台盼蓝染色，计数活细胞数，调整细胞浓度为1×10⁷/mL，于二氧化碳培养箱培养48h后，测定其细胞存活情况。

2.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述步骤1中的双抗为青霉素和链霉素，浓度为1％ (V/V)。

3.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是步骤1所述的肠段为空肠中段。

4.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是步骤2中所述的混合消化酶为胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ混合酶制剂其质量比为为2:1。

5.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤3中无血清RPMI-1640培养液为RPMI-1640细胞培养基中加入(V/V)0.5％双抗、1％ L-谷氨酰胺和1％羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.2～7.4。

6.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤4不同密度淋巴细胞分离液，经过密度为1.101g/mL的淋巴细胞分离液原液与PBS一定比例配制而得。

7.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤5中的磁珠二抗分选法，具体为先加入一定量TCR1抗体，保证其浓度可达每10⁷个细胞悬液中含有20μL抗体；孵化后，离心去上清；再加入磁珠，使其浓度达到每10⁷个细胞悬液中含有5μL磁珠，孵化离心去上清；PBS重悬细胞，进行细胞分选仪分选。

8.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤1中的禁食时间，24～36h为最佳禁食时间。