[发明专利]梅毒螺旋体IgG抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.梅毒螺旋体IgG抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于设有外包装盒、浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、反应终止液瓶、包被有重组抗原微孔板；

浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、反应终止液瓶和包被有重组抗原微孔板装在外包装盒内；

浓缩洗涤液瓶内装有浓缩洗涤液，阴性对照品瓶内装有阴性对照品，阳性对照品瓶内装有阳性对照品，生物素标记抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体瓶内装有生物素标记抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记亲和素瓶内装有辣根过氧化物酶标记亲和素，TMB显色液A瓶内装有TMB显色液A，显色液B瓶内装有显色液B，反应终止液瓶内装有反应终止液；

所述TMB显色液A为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，TMB)显色液；

所述显色液B为3％的过氧化氢溶液。

2.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液可采用溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0.05％。

3.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述阴性对照品为梅毒螺旋体总抗体阴性对照品，由非梅毒感染的健康人群血清配制而成。

4.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照品为梅毒螺旋体总抗体阳性对照品，由梅毒患者的阳性血清配制而成。

5.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述反应终止液为摩尔浓度2mmol/L的硫酸。

6.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取梅毒螺旋体Nichol株和Reiter株外膜蛋白进行双向电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，用梅毒血清进行免疫印迹实验，获得特征性的免疫印迹斑点，取对应的蛋白点进行质谱分析，分别找出Nichol株和Reiter株具有较高免疫原性的外膜蛋白，并找出Nichol株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白；

2)在梅毒螺旋体的全基因组序列中找出对应基因，设计引物并构建相应的表达载体。研究不同诱导条件对重组目标蛋白在大肠杆菌中表达量的影响，获得最佳诱导条件，大量扩增目标蛋白，收集过表达的目标蛋白进行纯化，纯度高于90％后，进行后续研究；

3)将步骤2)候选抗原，通过免疫大鼠获得其相应多克隆抗体，采用酶联免疫方法测定抗体滴度，并使用免疫印迹方法验证这些重组抗原的免疫原性；

4)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋重组抗原；

5)将步骤(4)中的梅毒螺旋重组抗原用包被缓冲液稀释至20ug/mL，以每孔0.1mL加入微孔板中，4℃包被24h；取出抗原板，风干；用0.01mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液配制的1.0％脱脂奶粉，每孔0.2mL，4℃封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、消毒、密封备用，得重组抗原包被微孔板；

6)以人IgG特异性片段γ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得稳定分泌抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

7)将抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，制备生物素标记抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体；

8)采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记，得辣根过氧化物酶标记亲和素；

9)TMB显色液A采用市售品，可购自厦门波生生物科技有限公司；

10)显色液B采用市售品，可购自厦门波生生物科技有限公司；

11)配制溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0.05％，得浓缩洗涤液，使用时可用蒸馏水进行20倍稀释；

12)配制2mmol/L的硫酸作为反应终止液；

13)由非梅毒感染的健康人群血清配制梅毒螺旋体IgG抗体阴性对照品，使用本试剂盒进行检测其OD450nm吸光值小于0.1；所述OD450nm为主波长，450nm是测定的样本显色吸光值；

14)由梅毒患者的阳性血清配制梅毒螺旋体IgG抗体阳性对照品，使用本试剂盒进行检测其OD450nm吸光值大于0.5；所述OD450nm为主波长，450nm是测定的样本显色吸光值；

15)将生物素标记抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、TMB显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、反应终止液、阴性对照品、阳性对照品分别装在瓶中，再将生物素标记抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、浓缩洗涤液瓶、反应终止液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶以及包被有重组抗原微孔板装入外包装盒中，得到梅毒螺旋体IgG抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒。