[发明专利]一种蜡样芽孢杆菌及其在制备亚硝酸盐还原酶中的应用

权利要求书

1.一种蜡样芽孢杆菌，其特征在于，该芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)LJ01，已于2014年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.9360。

2.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌在制备亚硝酸盐还原酶中的应用。

3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将处于对数期生长的蜡样芽孢杆菌LJ01的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，接种量为1％～5％体积百分比，进行诱导发酵培养，将得到的培养液离心得菌泥，用无菌水清洗后离心，得菌体并称重；

(2)加入提酶缓冲液，使LJ01菌体浓度为100mg/mL～500mg/mL，加入溶菌酶，混匀后进行LJ01菌体破壁，破壁后的菌液经离心后的上清液即为亚硝酸盐还原酶粗酶液。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述诱导发酵培养的条件为30℃～40℃，150r/min～250r/min摇床培养，发酵时间为18h～30h。

5.根据权利要求书3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述溶菌酶的浓度为5mg/mL～20mg/mL。

6.根据权利要求书3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述的提酶缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为1μg/mL～3μg/mL和0.5μmol/mL～2.0μmol/mL。

7.根据权利要求书3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述亚硝酸盐还原酶粗酶液还经过如下分离纯化步骤：所述粗酶液经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱和葡聚糖凝胶Sephadex G-150层析柱中的一种或两种层析，制得纯亚硝酸盐还原酶。

8.根据权利要求书7所述的应用，其特征在于，

阴离子交换层析是将粗酶液上样至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～500mM的NaCl的HEPES缓冲液进行NaCl梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的亚硝酸盐还原酶酶活，合并具有亚硝酸盐还原酶的组分，并用聚乙二醇20000浓缩；

葡聚糖凝胶层析是经阴离子交换层析后所得的亚硝酸盐还原酶组分上样至葡聚糖凝胶层析柱上，用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的亚硝酸盐还原酶酶活，合并具有亚硝酸盐还原酶酶活的组分。

9.根据权利要求书8所述的应用，其特征在于，

所述HEPES缓冲液的浓度为20mM～100mM，pH为7.0～7.6；

所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM～100mM，pH为7.8～8.6；

所述阴离子交换层析和葡聚糖凝胶层析中洗脱的流速分别为1mL/min和0.5mL/min。

10.根据权利要求书8所述的应用，其特征在于，所述的发酵诱导培养基为含50mg/mL～100mg/mL亚硝酸钠的肉汤培养基，pH7.0～7.6。