[发明专利]一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法

权利要求书

1.一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.制备人成纤维样细胞饲养层：取人成纤维样细胞，接种至培养皿上用10毫克/毫升丝裂霉素C提前处理3个小时，去除丝裂霉素C；

b.培养：重编程体细胞，生成人诱导多能干细胞，并将人诱导多能干细胞移植于步骤a中制备的饲养层中培养。

2.根据权利要求1所述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所述步骤a中人成纤维样细胞采用如下方法生成：

a1：使用人包皮成纤维细胞重编程得到人诱导多能干细胞5.9细胞系；

a2：在基质胶上维持培养5.9细胞系7天；

a3：使用1毫克/毫升分散酶于37℃环境下消化5-7分钟后进行传代培养，培养液为1，培养液每天更换；

a4：当培养于基质胶中的5.9细胞系达到80％满时，去除1培养基后用1×PBS清洗两次，然后直接添加人成纤维样细胞培养基使5.9细胞系开始定向分化，前四天每天更换培养基，之后每2天更换一次；

a5：诱导6～12天后将长满的细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA消化，并以1×10⁶个/孔的浓度把细胞接种在基质胶预处理的6孔板上；当细胞再次长满时，将细胞消化并以2×10⁵个/孔的浓度接种到0.1％明胶预处理的6孔板中；

a6：在明胶处理过的的平板上培养3-5天后细胞形态逐渐均一，即为人成纤维细胞样。

3.根据权利要求1所述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法,其特征在于,所述步骤b具体包括如下步骤：

b1:取1×10⁴人包皮成纤维细胞，采用杆状病毒介导的锌指核酸酶在第一天和第八天两次转染，将ZFN基因和OSKM基因同时转入细胞，使得OSKM基因特异性地整合到人包皮成纤维细胞的AAVS1位点，细胞培养液为FibroGRO^TM-LS完全培养基；

b2：使用200微克/毫升G418药筛10天后，将存活的细胞转移到人成纤维样细胞饲养层上培养形成细胞群落，得到人诱导多能干细胞。

4.根据权利要求3所述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所述步骤b1中，表达ZFN基因和OKSM基因的杆状病毒每个细胞的感染复数为100。

5.根据权利要求2所述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所使用的5.9细胞为60次连续传代的细胞。