[发明专利]一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法有效
申请号: | 201410382321.2 | 申请日: | 2014-08-06 |
公开(公告)号: | CN104140951A | 公开(公告)日: | 2014-11-12 |
发明(设计)人: | 王朔 | 申请(专利权)人: | 深圳市科晖瑞生物医药有限公司 |
主分类号: | C12N5/074 | 分类号: | C12N5/074;C12N5/071;C12N5/10 |
代理公司: | 深圳冠华专利事务所(普通合伙) 44267 | 代理人: | 诸兰芬 |
地址: | 518000 广东省深圳市福田区*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 建立 培养 诱导 多能 干细胞 方法 | ||
1.一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
a.制备人成纤维样细胞饲养层:取人成纤维样细胞,接种至培养皿上用10毫克/毫升丝裂霉素C提前处理3个小时,去除丝裂霉素C;
b.培养:重编程体细胞,生成人诱导多能干细胞,并将人诱导多能干细胞移植于步骤a中制备的饲养层中培养。
2.根据权利要求1所述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法,其特征在于,所述步骤a中人成纤维样细胞采用如下方法生成:
a1:使用人包皮成纤维细胞重编程得到人诱导多能干细胞5.9细胞系;
a2:在基质胶上维持培养5.9细胞系7天;
a3:使用1毫克/毫升分散酶于37℃环境下消化5-7分钟后进行传代培养,培养液为1,培养液每天更换;
a4:当培养于基质胶中的5.9细胞系达到80%满时,去除1培养基后用1×PBS清洗两次,然后直接添加人成纤维样细胞培养基使5.9细胞系开始定向分化,前四天每天更换培养基,之后每2天更换一次;
a5:诱导6~12天后将长满的细胞用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化,并以1×106个/孔的浓度把细胞接种在基质胶预处理的6孔板上;当细胞再次长满时,将细胞消化并以2×105个/孔的浓度接种到0.1%明胶预处理的6孔板中;
a6:在明胶处理过的的平板上培养3-5天后细胞形态逐渐均一,即为人成纤维细胞样。
3.根据权利要求1所述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法,其特征在于,所述步骤b具体包括如下步骤:
b1:取1×104人包皮成纤维细胞,采用杆状病毒介导的锌指核酸酶在第一天和第八天两次转染,将ZFN基因和OSKM基因同时转入细胞,使得OSKM基因特异性地整合到人包皮成纤维细胞的AAVS1位点,细胞培养液为FibroGROTM-LS完全培养基;
b2:使用200微克/毫升G418药筛10天后,将存活的细胞转移到人成纤维样细胞饲养层上培养形成细胞群落,得到人诱导多能干细胞。
4.根据权利要求3所述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法,其特征在于,所述步骤b1中,表达ZFN基因和OKSM基因的杆状病毒每个细胞的感染复数为100。
5.根据权利要求2所述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法,其特征在于,所使用的5.9细胞为60次连续传代的细胞。
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