[发明专利]一种工程菌及制备（3R,5R）6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种工程菌及利用该工程菌制备(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法。

背景技术

他汀类药物是一类羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性酶抑制剂药物，也是主要的降血脂药物。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA还原成3-甲基-3，5-二羟基戊酸的反应是胆固醇的生物合成途径，他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶的合成，可抑制体内胆固醇的合成，从而降低细胞游离胆固醇水平，反馈性上调细胞表面低密度脂蛋白受体表达，促进循环血液中极低密度脂蛋白胆固醇残粒和低密度脂蛋白的清除，最终降低血清中总胆固醇和低密度脂蛋白的水平，有效防止动脉粥样硬化和冠心病的发生。在结构上，他汀类药物通常由憎水性的刚性平面结构母核和具有双手性中心的(3R，5S/R)-双羟基己酸酯组成。其中，治疗心脑血管疾病的药物阿托伐他汀就是他汀类药物中的一种，而(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯则是阿托伐他汀的关键中间体。

(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯是合成伐他汀侧链的重要中间体，其化学结构为：

目前，在医药工业生产中，制备(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法很多，主要分为化学法和生物酶法。其中，公开号为WO2004094243A1的专利公开了一种以(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料制备(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法需要在低温以及硼烷和硼氢化钠作用下才能发生反应，造成整个工艺制备过程的安全性难以控制，工业化成本也较高，无法大面积推广生产。

相对而言，生物酶法的反应条件更加温和环保。例如公开号为WO2008042876A2的专利公开了一种以(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，通过生物酶的催化作用，室温下即可获得(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯。但是该制备方法存在操作步骤繁琐、成本高的问题。

公开号为WO2008/042876A2的专利也公开了利用酿酒酵母基因工程改造酮还原酶将6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯催化获得(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的工艺，并利用一种葡萄糖脱氢酶完成辅酶的再生反应，通过该工艺路线可获得立体异构纯的(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯。但是该工艺需要两种酶联合作用才能完成辅酶循环，造成生产成本升高。与此同时，反应中产生的葡萄糖酸会改变反应体系的pH值，需要通过补加碱溶液加以控制，增加了反应条件控制的难度，溶解在反应液中的葡萄糖酸也会大大增加后处理的难度。

因此，如何能够简化制备工艺，仅通过一种催化剂就能实现(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的制备，无大量反应副产物，且获得立体异构纯的(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯，是我们有待解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中的不足，提供一种利用工程菌制备(3R，5R)6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的一步化制备方法，简化制备工艺，降低生产成本。

一种工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因为卤代醇脱卤酶基因。

所述卤代醇脱卤酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。所述工程菌含有带卤代醇脱卤酶基因的表达载体pET-30a(+)。作为优选，卤代醇脱卤酶基因为hhdh基因，该基因为全合成基因，且连接在pMD18-HHDH质粒上。

宿主细胞为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

所述卤代醇脱卤酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，使工程菌分泌卤代醇脱卤酶，本发明的反应式为：