[发明专利]一种基于同种属来源第一抗体的免疫荧光双重标记方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学及生物技术应用领域，具体为一种利用两种同一种属来源的第一抗体进行免疫荧光双重标记的方法。

背景技术

在生物与医学研究中，免疫荧光化学染色是最为常用的技术手段之一，其原理是利用抗原与抗体特异性结合的原理，结合标记在抗体上的荧光素，通过荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色）从而使组织、细胞内多肽或蛋白质抗原的定位、定性、定量等信息在荧光显微镜下可视化。

在研究过程中，经常需要在同一细胞或组织标本中同时检测两种抗原/蛋白（例如A蛋白和B蛋白），以明确它们的共定位或共表达情况，此时就需应用免疫荧光双重标记技术，它可分为直接法和间接法：（1）直接法是将两种特异性抗体（抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体）分别以发出不同颜色的荧光素进行标记，例如，抗A蛋白抗体用异硫氰酸荧光素（FITC）标记发出黄绿色荧光，抗B蛋白抗体用四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记发出橙红色荧光，将两将荧光抗体按适当比例混合后，孵育组织或细胞后形成抗原抗体复合物，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，发出黄绿色荧光的即抗A蛋白抗体结合部位，发出橙红色荧光的即抗B蛋白抗体结合的部位，这样就能显示出两种抗原/蛋白的位置，同时可通过分析荧光强度来对目标抗原/蛋白定量。直接法的优点是简便方便，但灵敏度较低、抗体需要量大；（2）间接法是用未标记荧光素的不同种属来源的第一抗体（如鼠源性抗A蛋白抗体和兔源性抗B蛋白抗体）孵育组织或细胞后，再加入标记有不同荧光素的第二抗体（如抗鼠IgG-FITC或抗兔IgG-TRITC），从而对两种抗原/蛋白进行定位、定量。间接法因为通过第二抗体从而使标记的强度得到放大，所以效果灵敏、需要抗体较少，目前已基本取代了直接法，是免疫荧光标记和双重标记的主要方法。

近年发展出一种将SABC法和间接法相结合的免疫荧光双重标记方法。SABC即链霉亲和素-生物素-复合物（Strept-avidin biotin complex），生物素与亲和素具有天然的高亲和力。实验时，不同种属来源的第一抗体（如鼠源性抗A蛋白抗体和兔源性抗B蛋白抗体）分别与A和B抗原/蛋白结合后，利用生物素标记的第二抗体（如抗鼠IgG-biotin）孵育组织或细胞，之后加入荧光素Cy2标记的链霉亲和素（SA-Cy2）和抗兔IgG-TRITC，从而对两种抗原/蛋白进行显色。由于1个亲和素分子上有4个生物素结合位点，SABC法对荧光信号的放大效果是单纯间接法的5-10倍，因此具有更高的灵敏性。 

在应用免疫荧光双重标记技术时，必须注意的一点是：两种特异性第一抗体须来源于不同种属，即抗A蛋白抗体来源鼠，那么抗B蛋白抗体必须来源于鼠以外的其他种属，如兔、山羊或豚鼠等，这时使用与第一抗体种属相匹配的第二抗体才不会出现免疫交叉反应，从而保证结果的可靠性。然而在实际工作中，抗体的种属来源会受到诸多限制，特别是在研究一种新分子或因研究时间和经费限制，无法选择抗体的种属，必须要使用两种同种属来源的第一抗体时，目前的免疫荧光双重标记方法就存在着一定的局限性。

发明内容

本发明为了解决现有免疫荧光双重标记技术必须使用两种不同种属来源第一抗体的问题，提供一种新的免疫荧光化学染色技术，利用有限的抗体种属来源和普通荧光显微镜实现同种属来源的第一抗体在同一标本中的双重标记。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种基于同种属来源第一抗体的免疫荧光双重标记方法，其用两种同一种属来源的抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体对待检测标本中的A蛋白和B蛋白进行免疫荧光双重标记。

具体地说，是利用SABC免疫荧光法和间接免疫荧光法，在抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体为同一种属来源时对细胞或组织的A蛋白或B蛋白进行双重标记检测。

一种免疫荧光双重标记技术化学技术，利用两种同种属来源的第一抗体：抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体，包括以下步骤：

（1）确定抗A蛋白抗体最小应用浓度：

（a）将待测组织切片或细胞爬片入0.01 mol/L PBS清洗三次，每次5分钟；

（b）血清封闭；

（c）二倍梯度稀释A蛋白相应的第一抗体——抗A蛋白抗体，加入到待测组织切片或细胞爬片，4℃孵育24-48小时；

（d）PBS清洗三次，每次5分钟后，加入针对第一抗体种属来源的荧光素标记第二抗体，室温孵育2小时；

（e）PBS清洗两次，80%甘油缓冲液封片，荧光显微镜镜检，找出刚好不能另A蛋白显色的第一抗体最小工作浓度；

（2）SABC法检测A蛋白：