[发明专利]检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法及其应用有效

专利信息
申请号: 201310424225.5 申请日: 2013-09-17
公开(公告)号: CN103725793A 公开(公告)日: 2014-04-16
发明(设计)人: 施开创;莫胜兰;胡杰;邹联斌;张步娴;屈素洁;陆文俊;粟艳琼;苏凯;李军 申请(专利权)人: 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心
主分类号: C12Q1/70 分类号: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
代理公司: 广西南宁汇博专利代理有限公司 45114 代理人: 朱萍球
地址: 530001 广西壮族*** 国省代码: 广西;45
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 检测 prrsv 多重 荧光 定量 rt pcr 方法 及其 应用
【说明书】:

技术领域

发明属于动物病毒分子生物检测技术领域,具体涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重荧光定量RT-PCR方法,及其应用于同时对PRRSV美洲型经典毒株、美洲型变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株进行快速检测。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),又称“猪蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病,临床上主要表现为妊娠母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各种年龄猪特别是仔猪的严重呼吸道疾病。PRRS最早于1987年在美国发生,1991年荷兰首次分离到PRRSV,美国亦于1992年分离到该病毒。此后,该病相继在各主要养猪国家发生,现已呈世界性流行,给世界各国养猪业造成巨大的经济损失。根据病毒基因组的差异,PRRSV可分为欧洲型和美洲型毒株,两种基因型毒株之间基因组差异很大,核苷酸序列同源性仅为60 %左右。1996年郭宝清等首次在国内分离到PRRSV,证实该病在我国存在。2006年国内爆发高致病性猪蓝耳病(HP-PRRS),并证实其病原是以Nsp2蛋白481 aa和533~561 aa发生30个氨基酸不连续缺失为标志的高致病性变异毒株(HP-PRRSV)。2010年我国开始在临床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗,以便有效防控HP-PRRS。这些弱毒疫苗毒株包括由JXA1株致弱的JXA1-R株、由HuN4株致弱的HuN4-R株、由TJ株致弱的TJM-F92株等。其中,TJM–F92疫苗株是在HP-PRRS发病猪体内分离的高致病性强毒TJ 株通过噬斑筛选后,在Marc-145细胞上传代至92 代,获得了致弱的疫苗毒TJM–F92株。TJM–F92株Nsp2蛋白除了与其它HP-PRRSV一样在多变区不连续缺失30 aa以外,还出现了第1882~2441 aa共120个氨基酸(360个碱基)的连续缺失。2010年农业部批准临床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗以来,广西一直采购、使用TJM–F92株活疫苗,而未采购、使用其他弱毒株活疫苗,以便于正确区分临床发病猪体内的PRRSV野毒株和疫苗株。

当前,国内PRRSV美洲型流行毒株既有经典毒株,也有HP-PRRSV,加上临床使用的弱毒疫苗株,在临床检测中经常发现在同一地区甚至同一养殖场的猪群中同时存在两种或两种以上的病毒株,给该病的诊断带来极大的困难,这就使得建立PRRSV的快速鉴别检测方法显得尤为重要。迄今,国内外建立了一些技术,包括双抗体夹心ELISA、间接免疫荧光抗体试验(IFA)、原位杂交技术(ISH)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、单重及多重荧光定量RT-PCR等。但是已经建立的技术都无法同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及TJM-F92疫苗毒株。因此,建立能同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及TJM-F92疫苗株的检测方法不仅能弥补现有技术在这一领域的空白,还具有创新性实践意义。

荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,是指在PCR体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程,最后通过标准曲线对待测模板进行定性、定量分析的方法。由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、基因突变及其多态性的研究等多个领域。多重荧光定量PCR是荧光定量PCR的一种特殊形式,是在同一反应体系中加入多对引物和多条探针,同时扩增、检测多个模板的荧光定量PCR技术。

发明内容

本发明的目的是采用多重TaqMan荧光定量RT-PCR技术,针对PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株基因组中的保守序列,建立同时检测PRRSV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,提供同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的引物、探针及其方法。本发明特异性强、灵敏度高,操作安全方便,能实现PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株等三种毒株的同时检测,为PRRSV美洲型野毒株、弱毒疫苗株的同时快速鉴别检测及有效防控HP-PRRS提供了新的途径,具有良好的应用前景。

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于广西壮族自治区动物疫病预防控制中心,未经广西壮族自治区动物疫病预防控制中心许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201310424225.5/2.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

同类专利
  • 一种锦鲤疱疹病毒CPA检测引物及应用-201510180434.9
  • 徐进;曾令兵 - 中国水产科学研究院长江水产研究所
  • 2015-04-16 - 2019-11-08 - C12Q1/70
  • 本发明公开了一种锦鲤疱疹病毒CPA检测引物及应用。一种锦鲤疱疹病毒CPA检测试剂盒,包括以下成分:10×ThermoPol®Reaction Buffer;Bst DNA聚合酶;dNTPs;交叉引物CPF、CPR;检测引物DF、DR;剥离引物DPF、DPR;MgSO4;Betaine;核酸检测试纸条。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点,结果判定客观、直观,且成本低,使用方便,对人和环境都非常安全。本发明不仅可以在专业实验室使用,还可以应用于野外的现场快速检测,仅需一个金属浴或水浴锅,即可在1.5小时内准确检测出样品中的锦鲤疱疹病毒。
  • 长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1 表达检测引物及试剂盒-201710883276.2
  • 崔恒宓;胡序明;陈世豪 - 扬州大学
  • 2017-09-26 - 2019-11-05 - C12Q1/70
  • 本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种长链非编码RNA lnc‑ALVE1‑AS1表达检测引物及试剂盒。所述引物包括链特异性RT引物和荧光定量PCR检测引物;其中链特异性RT引物的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示;荧光定量PCR检测引物的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。本研究发明还提供了lnc‑ALVE1‑AS1表达检测试剂盒,为lnc‑ALVE1‑AS1表达规律分析提供了方法和基础,在生产实践可用于检测鸡群的禽白血病天然免疫状态。
  • 用于肺炎的微生物核酸检测试剂盒及其使用方法-201910440047.2
  • 不公告发明人 - 梅里埃诊断产品(上海)有限公司
  • 2019-05-24 - 2019-11-01 - C12Q1/70
  • 本发明提供了一种用于在一个样本中检测多个目标核酸序列的方法和装置,其包括在扩增反应物中提供具有不同已知浓度的一个或多个内部定量标准核酸,进行多重PCR扩增反应,其中所述一个或多个内部定量标准核酸的第二阶段扩增反应在不同反应容器内进行,根据在所述不同反应容器测得的每个所述定量标准核酸生成标准曲线,以对靶核酸进行定量分析或半定量分析。本发明还提供了所述方法用于检测多种肺炎相关致病微生物的应用和试剂盒。
  • 用于检测疱疹类病毒EBV的引物组及试剂盒-201810336564.0
  • 马东礼;刘孝荣;姜含芳;邢志浩;朱纯青 - 马东礼
  • 2018-04-16 - 2019-10-29 - C12Q1/70
  • 本发明涉及一种用于检测疱疹类病毒EBV的引物组。所述引物组包括分别针对EBV基因和内标的特异性引物及探针。本发明还涉及一种用于检测疱疹类病毒EBV的试剂盒。所述试剂盒包括PCR反应液、酶混合物、阴性对照品、阳性对照品和标准品,所述PCR反应液包括检测EBV基因和内标的特异性引物及探针。本发明提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、检测时间短、检测敏感性高及特异性好等优点,特别适合在临床检验工作中普及应用。
  • 基于恒温扩增的人乳头瘤病毒引物和分子信标组合、试剂盒及检测方法-201810343521.5
  • 蔺皓;邹国宝;魏颖颖;宋高尚;刘欣欣;周保强 - 中生方政生物技术股份有限公司
  • 2018-04-17 - 2019-10-29 - C12Q1/70
  • 本发明属于生物技术领域,公开了基于恒温扩增技术的快速检测人乳头瘤病毒的引物和分子信标组合、试剂盒及检测方法。本发明所述引物和分子信标组合如SEQ ID No.1‑17所示,可特异性的识别13种不同类型的高危HPV病毒、2种中国人群发病率较高的中危基因型。本发明所述试剂盒及基于恒温扩增技术荧光实时检测人乳头瘤病毒的方法,能在较短的时间内(1.5h)检测出15种中高危型HPV病毒,准确性好,灵敏度高,重复性强,特异性好,与临床上类似病原物均没有非特异性反应,而且使用方便,只需将提取的模板样本加入反应管中,人工操作时间少于5min,而且恒温扩增对仪器的温度控制要求不高,能够很好地应用于即时检测。
  • 用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒及检测方法-201910510373.6
  • 尹丽娟;周庆丰;彭鹏;曹永长;陈丽 - 温氏食品集团股份有限公司
  • 2019-06-13 - 2019-10-25 - C12Q1/70
  • 本发明提供一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒及检测方法,试剂盒包括PCR引物对和探针,所述PCR引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示,所述探针的序列如SEQ ID NO:3所示。检测的方法包括:以待检I亚群血清8型禽腺病毒样品DNA为模板,利用上述PCR引物对和探针进行荧光定量PCR扩增,采集荧光信号。本发明最低可以检测模板浓度为10copies/μL,比常规的PCR方法高出约100倍,其他常见的家禽病毒均无特异性扩增,没有发现交叉反应,批内和批间变异系数均小于1%。
  • 一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物LAMP检测试剂盒与检测方法-201910564909.2
  • 贺振;董婷婷;吴伟文;陈雯;李良俊 - 扬州大学
  • 2019-06-27 - 2019-10-25 - C12Q1/70
  • 本发明公开了一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物LAMP检测试剂盒与检测方法,其试剂盒包括1组特异性引物:SPLV‑lotusL,Prime Script™Reverse Transcriptase反转录酶、Oligo(dT)15 Primer、Ribonuclease Inhibitor抑制酶、dNTP、DNA Marker、pMD18‑T载体、RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、WarmStart®Colorimetric LAMP 2X Master Mix、WarmStart®LAMP Kit(DNA&RNA)。本发明在分子水平上为甘薯潜隐病毒莲藕分离物的检测提供了一种简单、快速、灵敏的方法,其敏感性和荧光定量RT‑PCR相当,具有替代PCR方法的可能性,适用于田间条件下检测莲藕中的甘薯潜隐病毒。
  • 一种快速检测Ⅰ群禽腺病毒的通用型二温式PCR引物和方法-201910673074.4
  • 赵磊;张训海 - 安徽科技学院
  • 2019-07-24 - 2019-10-25 - C12Q1/70
  • 本发明公开了一种快速检测I群禽腺病毒的通用型二温式PCR引物和方法,该二温式PCR方法含有一对特异性引物,且在检测I群禽腺病毒不同血清型之间具有通用性。试验证明,本发明方法有效避免了常规三温式PCR的不足之处,最快可在15分钟内完成扩增反应,而且具有灵敏度高、特异性强、组织适应性好、成本低等优点。本发明用于I群禽腺病毒感染引发疫病的快速诊断,以及携带I群禽腺病毒的禽类健康状况调查研究。
  • 一种基于免疫磁球的猪流行性腹泻病毒快速检测试剂盒-201910712611.1
  • 杨顺利;尹双辉;蔡建平;尚佑军;刘湘涛 - 中国农业科学院兰州兽医研究所
  • 2019-08-02 - 2019-10-25 - C12Q1/70
  • 本发明公开了一种基于免疫磁球的猪流行性腹泻病毒快速检测试剂盒,属于生物领域,该试剂盒包括有:免疫磁球,洗涤液,无菌无核酶水,标准阳性对照样品,检测引物,Real time RT‑PCR反应液;其中的免疫磁球表面具有PEDV膜蛋白特异性多克隆抗体。本发明利用表面(羧基化)修饰的磁球和抗PEDV膜蛋白M特异性兔源多克隆抗体制备了免疫磁球,能够特异性结合粪便、组织等多种样品中的PEDV病原,以免疫磁球‑病原复合物直接作为模板,进行Real time RT‑PCR检测,简化了实验操作步骤并节省了检测时间。
  • 一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物及应用-201510197194.3
  • 徐进;曾令兵;周勇 - 中国水产科学研究院长江水产研究所
  • 2015-04-23 - 2019-10-25 - C12Q1/70
  • 本发明公开了一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物及应用。一种大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒,包括以下成分:10×ThermoPol®Reaction Buffer;Bst DNA聚合酶;dNTPs;交叉引物CPF、CPR;检测引物DF、DR;剥离引物DPF、DPR;MgSO4;Betaine;核酸检测试纸条。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点,结果判定客观、直观,且成本低,使用方便,对人和环境都非常安全。本发明不仅可以在专业实验室使用,还可以应用于野外的现场快速检测,仅需一个金属浴或水浴锅,即可在1.5小时内准确检测出样品中的大鲵虹彩病毒。
  • 一种用于检测黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物及其应用-201910525050.4
  • 严佳文;解璞;袁启凤;马玉华;王立娟;陈楠 - 贵州省果树科学研究所
  • 2019-06-18 - 2019-10-22 - C12Q1/70
  • 本发明提供了一种用于检测黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物,所述引物中一对是鉴定黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物CMV‑657F和CMV‑657R,另一对是用于黄瓜花叶病毒西番莲分离物的实时荧光定量RT‑PCR的引物CMV‑174F和CMV‑174R,还提供了应用,用于黄瓜花叶病毒西番莲分离物的定量检测。本发明结合两对引物的定量检测方法灵敏度高、特异性强、检测结果准确,用于西番莲脱毒苗和田间感病植株的早期鉴定和病毒含量定量分析,为西番莲无病毒良种苗木繁育及推广提供技术支撑。该方法能够在4~5小时对样品中的黄瓜花叶病毒西番莲分离物进行准确定量,不仅节约了时间、简化了实验步骤,还有利于在植物发病之前采取相应的补救措施,防止该病毒在作物间广泛传播所带来的巨大经济损失。
  • 新型鹅星状病毒SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂盒-201910700274.4
  • 李宁;刘思当;蔡玉梅;杨玉栋;姜胜男;赵君 - 山东农业大学
  • 2019-07-31 - 2019-10-22 - C12Q1/70
  • 本发明公开了一种新型鹅星状病毒荧光定量PCR检测试剂盒。所述荧光定量PCR检测试剂盒中含有SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示的引物对,以及标准品质粒和荧光定量PCR反应试剂。本发明的荧光定量PCR试剂盒可以对新型鹅星状病毒进行检测,该试剂盒的特异性强,只与新型鹅星状病毒特异性结合,与其他鹅源病毒都没有交叉反应;而且检测的灵敏度高,在标准品为1×101‑1×107拷贝范围内都有极好的线性关系,可以高效检测新型鹅星状病毒病鹅组织以及无临床症状的病毒携带鹅,提高了检测效率。
专利分类
×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

400-8765-105周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top