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公布日期
2020-03-27 公布专利
2020-03-24 公布专利
2020-03-20 公布专利
2020-03-17 公布专利
2020-03-13 公布专利
2020-03-10 公布专利
2020-03-06 公布专利
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2020-02-28 公布专利
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检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法及其应用有效

申请号: CN201310424225.5 文献下载
申请日: 2013-09-17 公开/公告日: 2014-04-16
公开/公告号: CN103725793A 主分类号: C12Q1/70
申请/专利权人: 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心
发明/设计人: 施开创;莫胜兰;胡杰;邹联斌;张步娴;屈素洁;陆文俊;粟艳琼;苏凯;李军
分类号: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
搜索关键词: 检测 prrsv 多重 荧光 定量 rt pcr 方法 及其 应用
 
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地址: 530001 广西壮族*** 国省代码: 广西;45
代理公司: 广西南宁汇博专利代理有限公司 45114 代理人: 朱萍球
【说明书】:

一种检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法的应用,检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法用于快速检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、PRRSV美洲型变异毒株、高致病性PRRS活疫苗毒株。所述高致病性PRRS活疫苗株为TJM-F92株。高致病性PRRS活疫苗株的判定依据是检测样品出现两条扩增曲线,一条要类似于美洲型变异毒株标准曲线,另一条要类似于高致病性PRRS活疫苗株标准曲线。

发明的具体原理是,针对PRRSV美洲型经典毒株Nsp2基因、变异毒株Nsp2基因以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株Nsp2基因,设计了用于多重荧光定量RT-PCR检测的扩增引物和TaqMan 探针,分别使用FAM、JOE、TAMRA等基团作为探针的发光基团,设计并构建标准阳性质粒、计算出其拷贝数,建立阳性对照样品标准曲线,优化RT-PCR的反应体系,以及其反应步骤,以对应于荧光定量PCR仪的不同波长段用于同时检测,构建出基于引物和荧光探针的PRRSV多重荧光定量RT-PCR检测方法。本法具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点,用于快速检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、PRRSV美洲型变异毒株、高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株,弥补了现有技术在这一领域的空白,具有实用性。试验方法及具体过程如下:

1. 设计引物和探针。

针对PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的Nsp2基因,设计了用于多重荧光定量RT-PCR检测的扩增引物和TaqMan 探针,分别使用FAM、JOE、TAMRA等基团作为探针的发光基团F,以BHQ等基团作为探针的淬灭基团Q,以对应于荧光定量PCR仪的不同波长段用于同时检测。引物和探针序列如表1所示。

表1  检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR所用引物和探针序列

2.构建阳性质粒标准品。

以重组质粒p-Nsp2-VR2332、p-Nsp2-JXA1(上述质粒由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室保存)以及弱毒活疫苗TJM-F92株的cDNA为模版,以AM-PRRSV-F/R、TJM-PRRSV-F/R特异性引物分别进行PCR扩增得到195bp、108bp、133bp目的片段。用胶回收试剂盒纯化PCR产物后,连接到pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞,涂布于LB/Amp+/X-gal/IPTG培养平板。挑取阳性菌落进行增菌培养后,用质粒抽提试剂盒提取质粒,进行PCR、酶切及测序鉴定。构建的重组质粒标准品,各命名为 p-C-Nsp2、p-V-Nsp2和p-TJM-F92。用紫外分光光度计测定质粒的光吸收值(OD260 ),计算出摩尔浓度,根据公式换算成拷贝数:每μL样品中检测基因的拷贝数=浓度(ng/μL)×阿佛加德罗常数×10-9/(660×重组质粒碱基数)。质粒置于-20℃保存,用前稀释。

3. 优化多重荧光定量RT-PCR的反应体系

通过反复试验,优化多重荧光定量RT-PCR的反应体系,确定采用的RT-PCR反应体系为总体积25μL,所需各组分及相应浓度、相应用量见表2。表中作为阳性对照样品的模板表示:p-C-Nsp2、p-V-Nsp2、p-TJM-F92阳性质粒标准品按体积比例1:1:2混合总共2 μL,用灭菌双蒸水补至 25 μL。其中三种阳性质粒标准品浓度如下:p-C-Nsp2 为 5.67×109拷贝/μL,p-V-Nsp2为6.86×109拷贝/μL,p-TJM-F92为3.45×109拷贝/μL,按优化好的比例混合,以双蒸水作10 倍系列稀释成 7 个梯度,p-C-Nsp2为5.67×109~5.67×103拷贝/μL,p-V-Nsp2为6.86×109~6.86×103拷贝/μL,p-TJM-F92 为3.45×109~3.45×103拷贝/μL。作为检测样品的模板为从疑似PRRSV感染的动物组织或血清抽提的总RNA反转录获得的cDNA。检测样品cDNA获得过程为:按宝生物工程(大连)有限公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒使用说明从疑似PRRSV感染的动物组织或血清抽提总RNA后,应用PCR试剂盒, 在高压灭菌后的PCR反应管内,以抽提的总RNA为模板,按RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒使用说明进行反转录,获得cDNA。反转录(RT)反应程序:①30℃ 10min;②42℃ 30min;③99℃ 5min。所获得的cDNA,置于-20℃保存备用。

表2  检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR反应体系

反应体系组分用量(μL)Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)12.5AM-PRRSV上游引物(25pmol/μL)0.4AM-PRRSV下游引物(25pmol/μL)0.4AM-V-PRRSV-P探针(25pmol/μL)0.25AM-C-PRRSV-P探针(25pmol/μL)0.4TJM-PRRSV上游引物(25pmol/μL)1.2TJM-PRRSV下游引物(25pmol/μL)1.2TJM-PRRSV-P探针(25pmol/μL)0.7ROX 参比染料0.5模板2双蒸水5.45总体积25ul

4.多重荧光定量RT-PCR反应条件优化如下:

多重荧光定量RT-PCR扩增条件:95℃ 2min;95℃ 10s, 54℃ 30s,40 个循环,同时收集荧光信号。

与现有技术相比,本发明的有益效果是:

(1)本发明设计了特异性强的PRRSV多重荧光定量RT-PCR扩增引物和探针,建立了一种同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、PRRSV美洲型变异毒株、高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的多重荧光定量RT-PCR检测方法,弥补了现有技术在这一领域的空白,引物和探针检测灵敏度可达10拷贝/ul,为检测PRRSV美洲型野毒株、弱毒活疫苗株提供了一种特异、敏感、快速、高效的方法。

(2)本发明的多重荧光定量RT-PCR检测方法扩增反应快速、高效、简便,整个扩增不到1个小时即可完成,无需凝胶电泳,操作安全方便,提高了工作效率,降低了检测成本。

(3)本发明以三种质粒标准品混合液为模板,进行多重TaqMan荧光定量PCR,p-V-Nsp2、p-C-Nsp2、p-TJM-F92的灵敏度测试结果表明,其检出下限均为10拷贝/μL,普通 PCR 的检出下限为103个拷贝/μL,表明多重TaqMan荧光定量PCR比普通 PCR 敏感 100倍。

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