[发明专利]副猪嗜血杆菌菌体蛋白的提取及双向电泳方法无效

专利信息
申请号: 201310324355.1 申请日: 2013-07-30
公开(公告)号: CN103360460A 公开(公告)日: 2013-10-23
发明(设计)人: 谢宇舟;李军;彭昊;密克;陈泽祥;胡帅;潘艳;杨威;谢永平;禤雄标;马春霞;许力干 申请(专利权)人: 广西壮族自治区兽医研究所
主分类号: C07K1/14 分类号: C07K1/14;G01N27/447
代理公司: 广西南宁公平专利事务所有限责任公司 45104 代理人: 杨立华
地址: 530001 广西壮族*** 国省代码: 广西;45
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摘要:
搜索关键词: 嗜血 杆菌 菌体 蛋白 提取 双向 电泳 方法
【说明书】:

技术领域

发明属于副猪嗜血杆菌蛋白质组技术领域,尤其涉及一种副猪嗜血杆菌菌体蛋白的提取及双向电泳方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemphilus parasuis,HPS)是Glasser’s病的病原菌,它是嗜血杆菌属的一种革兰氏阴性杆菌。Kielstein等将该菌分为15个血清型,其中1、5、10、12、13、14血清型被归类于强毒力毒株,2、4、15血清型属于中毒力毒株,而3、6、7、8、9、11血清型菌株则被认为没有毒力。所有的血清型当中4、5型在中国流行区域较广,造成的危害也最为严重。

目前学者们对HPS的研究大多集中在菌株的分离、血清型的鉴定及其致病因子的探索和血清学诊断上面:Ruiz等提出HPS的毒力与其外膜蛋白(OMP)直接相关——患病猪与健康猪体内分离到的HPS的OMP明显不同;王艳等建立了HPS的间接ELISA检测方法,其精确性和特异性明显高于普通细菌检测方法。研究人员对HPS的基因的鉴定和进化分析的研究也在逐步展开:薛晓晶等对HPS的aroA基因进行了鉴定及遗传进化分析。

基于双向电泳(2D)的蛋白质组学技术能从整体水平上探索细胞某一个时间点所有蛋白质的表达情况。区别于单个基因或单个蛋白质的研究,蛋白质组学可以高通量、大范围的揭示细胞内某些蛋白的表达差异性对该细胞生理功能产生的系统影响:例如,大肠杆菌O157:H7和O157的差异蛋白质组学研究提示,两种不同血清型的大肠杆菌的致病力差异可能来自于若干蛋白质的表达差异。另外,蛋白质组学研究中发现的某些差异蛋白有可能成为新型治疗方法或诊断方法中有潜力的靶标。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种副猪嗜血杆菌菌体蛋白的提取及双向电泳方法,以获得副猪嗜血杆菌总蛋白并适用于双向凝胶电泳分析,便于深入开展副猪嗜血杆菌的蛋白质组学研究,从而高通量、大范围地揭示副猪嗜血杆菌细胞内某些蛋白的表达差异性对其生理功能产生的系统影响。

为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:副猪嗜血杆菌菌体蛋白的提取方法,包括以下步骤:

<1>菌体前处理

将在TSA培养基中培养36小时的单菌落接种于TSB培养基中,37℃摇床培养36h;4℃,13000rpm/min,10min离心收集菌体,PBS洗涤三次,弃去上清;

<2>菌体裂解

往步骤<1>获得的菌体沉淀中加入适量裂解液,使沉淀菌体重新悬浮于裂解液中,冰浴超声5min后,4℃过夜裂解;

<3>菌体蛋白粗提

经步骤<2>从细菌中分离出的粗蛋白混合液,4℃,13000rpm/min离心,10min,取上清,6倍体积含0.07%DTT、10%TCA的丙酮溶液沉淀30min;4℃,13000rpm/min离心,20min,弃上清;沉淀物用含0.07%DTT的丙酮溶液重新悬浮10min,4℃,13000rpm/min离心,10min弃上清,重复2次;裂解液复溶,4℃,13000rpm/min离心,上清即为粗提的菌体蛋白。

上述提取方法步骤<2>中裂解液含7M urea,2M thiourea,4%w/v CHAPS,1%DTT,1mM PMSF;冰浴超声功率200w,工作9.9s间隔9.9s。

上述提取方法还包括以下步骤:

<4>菌体蛋白纯化

用2-D clean up kit蛋白质纯化试剂盒纯化粗提蛋白。

上述副猪嗜血杆菌菌体蛋白的双向电泳方法,包括以下步骤:

<1>第一向等电聚焦电泳

纯化的副猪嗜血杆菌菌体蛋白样品分别采用pH3-10,pH3-10NL或pH4-7的24cm的IPG胶条进行第一向等电聚焦电泳;样品首先加载于两性电解质溶液中水化;

<2>平衡

步骤<1>的等电聚焦电泳结束后,IPG胶条首先在平衡缓冲液Ⅰ中平衡15min后,再在平衡缓冲液Ⅱ中平衡15min;

<3>第二向SDS-PAGE电泳

步骤<2>的平衡完毕后,IPG胶条放置于浓度为12.5%的SDS-PAGE凝胶上,覆盖含有0.002%溴酚蓝的0.5%低熔点琼脂糖封顶,进行第二向SDS-PAGE电泳,600V,400mA,2W/胶0.5h后,600V,400mA,20W/胶,至电泳结束。

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  • 秦钧;汪宜;丁琛;石文昊;宋雷;王钰珅;李恺;刘明伟 - 北京谷海天目生物医学科技有限公司
  • 2019-04-28 - 2019-08-16 - C07K1/14
  • 本发明公开了一种磷酸化肽段富集的方法、检测和定量的方法。其中,磷酸化肽段富集的方法包括蛋白质组样本的裂解、酶解和基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤,其中,蛋白质组样本的裂解、酶解后得到的溶液中包含磷酸化肽段和非磷酸化肽段,磷酸化肽段和非磷酸化肽段之和为总肽段,在基于二氧化钛的磷酸化肽段富集的步骤中二氧化钛与总肽段的质量比例为10~100:1。微量样本的应用使得初始肽段需求降至微克级别,扩展了可以检测的样本范围。进一步的,应用脱氧胆酸钠裂解液高效裂解组织或者细胞,结合二氧化钛对磷酸化肽段进行富集,最后应用高效液质联用系统进行单组分检测和定量,可以高效快速的在微量样本中富集和定量磷酸化肽段。
  • 一种浓缩蛋白浸出装置-201821372462.6
  • 李海旺 - 河南工业大学
  • 2018-08-24 - 2019-08-13 - C07K1/14
  • 本实用新型公开了一种浓缩蛋白浸出装置,包括浸出筒和外罩壳,所述浸出筒和所述外罩壳均为U型筒体结构,且水平设置,所述浸出筒套接在所述外罩壳内,所述外罩壳顶部设置有封板,所述浸出筒上端固定连接在所述封板上,所述封板的中部设置有进料斗,所述外罩壳两端分别设置有可拆卸的端盖,能够对所述外罩壳和所述浸出筒的两端进行封堵;其中一侧的所述端盖上安装有顶推滑杆,且所述顶推滑杆为T型圆柱,所述顶推滑杆滑动安装在所述端盖上。有益效果在于:通过第一挤压板对豆粕进行挤压,从而使蛋白液快速从豆粕中浸出,同时还可提高豆粕中蛋白液的提取率;能够将混合料均匀导入浸出筒内,从而避免局部物料堆积,提高浓缩蛋白液的浸出速度。
  • 一种多肽纯化制备装置-201821831767.9
  • 施学庚;朱国基;巢庆;乔立超;袁长在;闻凡;张倩 - 希施生物科技(上海)有限公司
  • 2018-11-06 - 2019-08-13 - C07K1/14
  • 本实用新型公开了一种多肽纯化制备装置,包括筒体、真空泵、溶液入口、洗脱液罐、筛板固定机构和溶液出口,所述筒体的下端设置有底盖,所述底盖的下端设置有溶液出口,所述筒体的内部设置有筛板固定机构,所述筒体的底部两侧设置有支脚。本实用新型通过筛板固定机构来固定筛板,结构简单,牢固可靠,通过支撑环与筒体尺寸对应卡合,再通过卡扣固定,安装拆卸方便,方便取下来清理筛板以及填充吸附剂,从而提高多肽的纯化率,同时,本实用新型通过真空泵给筒体加压,通过气压管柱设定气压,低于设定就加压至合适气压,使洗脱速度变快,避免随着液体流出以及空气流失,液体流出速度变慢,洗脱速度减慢的弊端。
  • 一种工业制备级蛋白质分离纯化器-201910478752.1
  • 段春光 - 嘉兴宜鸿贸易有限公司
  • 2019-06-03 - 2019-08-09 - C07K1/14
  • 本发明公开了一种工业制备级蛋白质分离纯化器,包括工作台,所述工作台中的左端设有传动空间,所述传动空间的下端壁有电机滑块,所述电机滑块中设有动力装置,所述传动空间的右端设有工作空间,所述工作空间的下端设有离心空间,本装置结构能够对绝大多数固体液体进行离心分离,能够对不同大小的固体选择不同粗细的滤网,保证了分离的彻底性与工作效率,而清洗装置的水再利用降低了装置的能量消耗,节约了能源,通过机械的传动配合,提高了蛋白质分离纯化效率,降低了出错的可能性,同时使用一电机实现多功能,降低了装置的成本。
  • 一种磷酸化多肽富集的辅助装置-201821917095.3
  • 刘宜子;陈希;韩强强;尚骏;杜博贾;陈继锋 - 谱度众合(武汉)生命科技有限公司
  • 2018-11-21 - 2019-08-09 - C07K1/14
  • 一种磷酸化多肽富集的辅助装置,包括圆台型聚丙烯吸头、实验室用玻璃棉、富集微珠、扁头夹子、注射器,将实验室用玻璃棉揉成一束,塞进聚丙烯吸头较细的一端,使用扁头夹子夹紧吸头较细的一端以固定玻璃棉,富集微珠填充在吸头内玻璃棉上方。注射器接头为圆台型,其圆心角与聚丙烯吸头的圆心角大小相同,且注射器接头外壁涂有一层硅胶。聚丙烯吸头容积为200微升,长83mm,较细的一端吸孔直径为0.2mm。注射器为50毫升注射器。该辅助装置便于微量磷酸化多肽的富集,同时能降低磷酸化多肽的损失。
  • 一种磁力架-201821942348.2
  • 米继东;李翠芬 - 嘉兴领宇科技有限公司
  • 2018-11-23 - 2019-08-09 - C07K1/14
  • 本实用新型涉及生物装置领域,公开了一种磁力架,包括试管架组件,所述试管架组件设置有用于插放试管的试管孔,所述试管架组件中部还设置有通孔;所述通孔内转动安装永磁体,所述永磁体用于将所述试管内的磁珠微颗粒聚集吸附在所述试管管壁上。本实用新型提供的磁力架,通过转动永磁体实现磁力架磁场的开关,操作简单方便,清洗释放磁珠只需转动永磁体即可,省时省力。
  • 一种动物血的新型抗凝设备-201821606334.3
  • 熊开宝;熊开林 - 湖南璟荣生物科技有限公司
  • 2018-09-29 - 2019-08-06 - C07K1/14
  • 本实用新型提供一种动物血的新型抗凝设备,包括用于抗凝剂配置的配置桶、及用于收集血液的抗凝池,所述配置桶通过连接管与抗凝池连接,将配置桶内的抗凝溶液输送至抗凝池内,并通过气动隔膜泵对输入有抗凝溶液的血液进行从低至高泵送的方法进行搅拌,以实现自动化搅拌工作,减少了操作人员的劳动强度,同时增加了血液处理的工作效率,有效的保证了血液的抗凝效果。
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