[发明专利]一种利用胶体金免疫层析技术定量检测血清胃蛋白酶原的试纸条及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种利用胶体金免疫层析技术定量检测血清胃蛋白酶原的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括分别用于胃蛋白酶原I以及用于胃蛋白酶原Ⅱ检测的试纸条，所述的试纸条按照连接顺序依次包括样品垫（4）、金标垫（3）、硝酸纤维素膜（2）以及吸水垫（5），还包括位于下方的塑料底衬（1）、其中塑料底衬（1）的作用是提供组装平台，硝酸纤维素膜（2）上具有胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原Ⅱ喷涂的质控线，以及胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原Ⅱ的二抗喷涂的检测线，金标垫（3）上涂覆有胶体金颗粒标记的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原Ⅱ的单克隆抗体，样品垫（4）提供了待测样品加入的位置。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原Ⅱ为人胃蛋白原抗原I或蛋白酶抗原II的天然蛋白。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原Ⅱ是按照以下方法制备得到的：

（1）收集外科手术切除的正常人胃组织，用磷酸盐缓冲液漂洗，分离胃粘膜，吸干，称重，加入磷酸盐缓冲液，捣碎匀浆，离心，收集上清，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再次离心，合并上清液，得到胃蛋白酶原粗提液；

（2）将胃蛋白酶原粗提液加入已经平衡的DEAE-52层析柱，用PBS缓冲液洗脱层析柱至在280nm处，吸光值为0，继续用PBS缓冲液洗脱层析柱，合并洗脱峰，得到含有活性的胃蛋白酶原；

（3）取活性胃蛋白酶原峰，上样于凝胶层析柱，用50-80mM的含0.05-0.1mol/LNa₂SO₄的PBS洗脱，流速3.0-5.0ml/min，压力为8Kpa，洗脱曲线为显示4个蛋白洗脱峰，第三个蛋白峰即为胃蛋白酶原I，第四个蛋白峰为胃蛋白酶原I及胃蛋白酶原II的混合物；

（4）采用Q-2阴离子交换层析柱分离胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的混合物，凝胶层析后的第四个洗脱峰先用0.05-0.1mol/L This-HCL，pH7.0透析后上样阴离子层析柱，用浓度为0—0.5mol/L NaCl梯度洗脱，流速为1ml/min；出现三个蛋白峰，其中第1，2个峰为胃蛋白酶原I，第三峰为胃蛋白酶原II。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的胶体金颗粒标记的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原Ⅱ的单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：

（1）胶体金的制备

先将100ml的0.01%氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入1ml的1%柠檬酸三钠溶液，煮沸7-10min出现透明的酒红色，最后加蒸馏水至100ml，然后用电镜镜检，制备的金颗粒大小一致，均匀，颗粒直径为40nm；

（2）单克隆抗体的标记

待标记的抗体蛋白用0.005-0.1mol/L的氯化钠溶液透析48小时除盐，然后用制备好的颗粒直径为40nm的胶体金来标记单克隆抗体蛋白，具体步骤为：

①向搅拌中的胶体金溶液里迅速加入抗体蛋白，25℃室温孵育15-30min；

②用0.1-0.5mol/L的K₂CO₃调节胶体金溶液的pH为7.0-7.6，然后加入1-10%BSA封闭，反应15-20min；

③10000rpm离心20-30min，弃上清，再用pH为7.5-8.0的含1-10%BSA的2-6mM的硼酸盐缓冲液洗涤，共洗涤3次；

④最后加入pH7.4的含4-10%蔗糖、6-10%海藻糖、0.05-1%BSA和2mM硼酸盐缓冲液中，4℃储存备用。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于步骤（2）单克隆抗体的标记是按照以下方法制备得到的：

待标记的单克隆抗体蛋白用0.1mol/L的氯化钠溶液透析48小时除盐，然后用制备好的颗粒直径为40nm的胶体金来标记单克隆抗体蛋白，具体步骤为：

①向搅拌中的胶体金溶液里迅速加入单克隆抗体蛋白，25℃室温孵育25min；

②用0.1mol/L的K₂CO₃调节金溶液的pH为7.0，然后加入5%BSA封闭，反应20min；

③10000rpm离心20min，弃上清，再用pH为7.5的含5%BSA的4mM的硼酸盐缓冲液洗涤，共洗涤3次；

④最后加入pH7.4含7%蔗糖、8%海藻糖、0.5%BSA的2mM硼酸盐缓冲液中，4℃储存备用。