[发明专利]来源于里氏木霉的一个蛋白质及其基因的用途

说明书

技术领域

本发明涉及来源于里氏木霉的一个蛋白质及其基因的用途，特别涉及来源于里氏木霉的Trfog1在调控里氏木霉的胞外蛋白的分泌量中的应用。

背景技术

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei)是一种嗜温的腐生真菌，被广泛应用于生产食品、饲料、纺织、制浆和造纸等行业用纤维素和半纤维素酶。目前已成为研究纤维素降解的重要模式菌株。里氏木霉是FDA认证的安全生产菌株，具有强大的蛋白分泌能力，并且具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统，因此里氏木霉也是一种非常理想的重组蛋白表达宿主。为了进一步提高里氏木霉的纤维素酶半纤维素酶产量，同时提高其表达异源蛋白的分泌量，近年来，如何提高里氏木霉的胞外蛋白合成分泌量成为研究热点。

目前研究表明里氏木霉纤维素酶基因的表达调控是在转录水平进行的，受到转录激活因子的促进和碳代谢抑制蛋白的阻遏，在以往的研究中，人们采用基因克隆、酵母杂交等传统方法分离、仅仅鉴定了3个转录激活因子（Ace2、Hap2/3/5、Xyr1）和2个阻遏蛋白（CreⅠ、AceⅠ）。同时也有研究表明阻遏蛋白的缺失可以显著提高里氏木霉外分泌蛋白的表达水平。基于里氏木霉纤维素酶表达调控的复杂性，在其转录调控过程中应该还有许多关键的调控因子仍然没被发现。通过对一些具有转录因子典型结构的蛋白进行功能分析，研究其在纤维素酶半纤维素酶生物合成中的作用有望从机制本身进一步提高里氏木霉合成和分泌蛋白的能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供来源于里氏木霉的Trfog1蛋白的用途。

本发明所提供的一个用途是Trfog1在调控里氏木霉（Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量中的应用；所述Trfog1是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。

其中，序列表中序列2由363个氨基酸残基组成。Trfog1的理论分子量为40.8kDa，等电点为9.231。

所述胞外蛋白包括里氏木霉（Trichoderma reesei)的内源蛋白，如纤维素酶和/或半纤维素酶，还可包括导入里氏木霉（Trichoderma reesei)的外源蛋白。

其中，在不包含外源蛋白的里氏木霉菌株中，所述调控里氏木霉（Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量可体现为调控纤维素酶和/或半纤维素酶的分泌量。

本申请的实验证明，将里氏木霉出发菌株中的Trfog1基因敲除后得到了胞外蛋白分泌量明显增加，特别是纤维素酶分泌量明显增加的Trfog1基因敲除株，说明Trfog1是与里氏木霉（Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量相关的一个蛋白。

本发明还提供了构建Trfog1基因敲除株（一种重组里氏木霉菌）的具体方法。

本发明所提供的制备重组里氏木霉菌的方法，包括敲除里氏木霉（Trichoderma reesei)中的Trfog1基因得到所述重组里氏木霉菌的步骤，所述Trfog1是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。

所述Trfog1基因可为基因组基因也可为cDNA基因，序列表中的序列1为Trfog1的cDNA基因，共有1092bp；序列表中序列5的第2501-3660为Trfog1的基因组基因，共有1160bp。

所述方法中可通过同源重组、随机插入突变或RNAi敲除里氏木霉（Trichoderma reesei)中的Trfog1基因。

其中，用于发生同源重组的组件（敲除组件）由Trfog1基因上下游同源臂及在所述Trfog1基因上下游同源臂之间插入的便于筛选转化子的筛选标记基因组成。

本发明序列表中的序列5给出了里氏木霉Trfog1基因及其上下游各2500bp的基因组DNA序列，序列表中的序列5的第1-2500位为所述Trfog1基因上游2500bp序列，序列表中的序列5的第3601-6160位为所述Trfog1基因下游2500bp序列，所述Trfog1基因及其上下游序列可见如下网站：http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/dispGeneModel?db=Trire2&tid=108357。