[发明专利]木聚糖酶的表达方法及其专用DNA片段

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过密码子优化技术改造耐热木聚糖酶基因xynB以实现其在毕赤酵母中高效表达的技术方法。本发明还涉及重组巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-xynBop的高密度发酵方法。

背景技术

木聚糖是半纤维素的主要组成部分，广泛分布于高等植物的细胞壁中，是自然界中储量巨大的可再生生物资源，仅次于纤维素。木聚糖的降解酶系主要包括β-D-1，4-内切木聚糖酶(β-D-1，4-xylanase，EC 3.2.1.8)和β-木糖苷酶(β-D-1，4-xylosidase，EC 3.2.1.37)。β-D-1，4-内切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)能够以内切方式随机作用于木聚糖主链内部的木糖苷键，将其分解成不同长度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶。木聚糖酶可广泛应用于生物转化、食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业。木聚糖酶可由多种微生物产生，但由于一般微生物所产的木聚糖酶为中低温或偏酸性，大大限制了其在工业上的应用。

在许多应用木聚糖酶的工业中，常常需要在高温条件下进行反应，这就需要木聚糖酶具有良好的热稳定性。目前已在多种耐热微生物中发现了热稳定性良好的木聚糖酶，然而耐热的微生物往往培养困难，有的还需要在高温厌氧条件下培养，产酶量低且酶系复杂难以纯化，严重限制了其应用和发展。

极端嗜热菌海栖热袍菌MSB8的木聚糖酶基因xynB已经被克隆在毕赤酵母(申请号为：200310113562.9)中进行了表达，重组酶的最适温度为90℃，在中性和偏碱性环境中热稳定性好。杨梦华(微生物学报，2005，45(2)：236-240)等将xynB基因在毕赤酵母中进行了表达，经5L发酵罐诱导培养5d后，重组木聚糖酶分泌表达量为207mg/L。

毕赤酵母异源基因表达系统是近年来应用得较多的酵母表达系统，既具有原核表达系统操作简单、高分泌表达、易于调控等特点，还具有真核细胞特有的翻译后修饰功能。另外，该表达系统还利于进行菌体高密度发酵。这些优点使得毕赤酵母被广泛用作外源基因表达系统，表达各种外源蛋白。研究发现，根据毕赤酵母密码子偏爱性进行密码子优化可以提高外源基因表达水平10-50倍(Sinclair and Choy，ProteinExpression and Purification，2002，26：96-105；Nikolay et al.，ProteinExpression and Purification.2002，2002，24：18-24)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过密码子优化技术改造的耐热木聚糖酶基因xynB。

本发明提供的基因(xynB)，是如下1)或2)：

1)其编码序列如序列表中序列1的第58-1044所示；

2)其编码序列如序列表中序列1所示。

含有上述基因的表达盒、重组载体或转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体具体可以是将上述基因插入酵母表达载体的多克隆位点中得到的重组表达载体。

上述酵母表达载体可以为pPIC9K。

含有上述基因的重组菌也属于本发明的保护范围之内。

进一步讲，上述重组菌是将上述的重组载体导入毕赤酵母得到的重组菌。

本发明的另一目的在于提供一种生产木聚糖酶的方法。

本发明提供的方法是将上述的重组菌进行发酵，得到所述木聚糖酶。

上述发酵可以包括基础培养、甘油分批补料培养和甲醇诱导三个阶段；所述基础培养阶段的温度为30℃，时间为18-24小时，pH值为3.5-4.5；所述甘油分批补料培养阶段的温度为30℃，DO＞20％，pH值为3.5-4.5；所述甲醇诱导阶段的DO＞15％、发酵温度30℃，pH值为5.5-6.5。

采用以上技术方案后，本发明的重组毕赤酵母经5L发酵罐高密度发酵结果显示，诱导表达228h后发酵上清液酶活达到最高，为41,000U/mL，粗蛋白含量达10.1g/L。杨梦华等(微生物学报，2005，45(2)：236-240))将该基因(序列表中序列2所示的基因)在毕赤酵母的进行表达，经5L发酵罐诱导培养5d后，木聚糖酶分泌表达量为207mg/L。因此，该研究经过密码子优化，大大提高了该基因的表达量，为其工业化应用提供了重要途径。

附图说明