[发明专利]抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺

权利要求书

1.一种抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

S1、构建表达沙门菌SEF14和SEF21菌毛抗原的大肠杆菌，具体分步如下：

S11、分别将含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列的DNA片段与pET20b(+)载体连接，然后分别对连接的片段进行扩增，此时原核表达载体pET20b(+)-SEF14以及pET20b(+)-SEF21两种质粒分别构建成功；

S12、分别将两种所述质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中；

S13、经IPTG诱导1-2小时后，收集菌体，超声波打碎、离心获得包涵体后，利用镍柱子层析纯化；

S14、分别利用纯化的原核表达SEF14、SEF21蛋白制备兔抗SEF14、SEF21多克隆抗体；

S2、制备脂质体包裹的SEF14和SEF21抗原，具体分步如下：

S21、将二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、胆固醇按1∶1∶2的比例充分混合；

S22、将混合的脂类干燥，制成脂质体混合物；

S23、将所述混合物与所述SEF14、SEF21按照质量比2-3∶1∶1的比例充分混合；

S24、在1600rpm强度下进行脂质膜涡旋式分散，获得的脂质体包裹SEF14和SEF21口服疫苗。

2.根据权利要求1所述抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，步骤S1之前，获得所述含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列DNA片段的步骤为：

S01、根据GenBank accession number L03833.142-573提供的SEF14菌毛抗原基因序列，设计引物如下：

上游引物：5’-GGAATTC CATATG GCTGGCTT TGTTGGTAA-3’

下游引物：5’-CCG CTCGAG GTTTTGATACTGCTGAACG-3’

根据GenBank accession number S76043.提供的SEF21菌毛抗原基因序列，设计引物如下：

上游引物：5’-GGAATTC CATATG ATGAAACATAA ATTAATGA-3’

下游引物：5’-CCG CTCGAG TTATTCGTATTTCATGATAAAGGTG-3’

S02、以含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列为模板，分别经PCR扩增出SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列的DNA片段。

3.根据权利要求1或2所述抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，步骤S22具体步骤为：将混合的脂类在旋转蒸发器上进行干燥20-30分钟，然后再置于高真空干燥器上干燥，制成脂质体混合物。

4.根据权利要求3所述抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，在步骤S24之后，1000-1500rpm离心，弃去离心后的上层液，将没有被脂质体包裹的菌毛抗原去除。

5.根据权利要求4所述抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，最终检测所述SEF14和SEF21口服疫苗的方法为：首先利用异丙醇溶解脂质体，用PBS稀释，采用涡旋混合器充分搅拌混匀，而后利用蛋白质检测试剂盒测定脂质体包裹SEF14和SEF21的量。

6.根据权利要求5所述抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，步骤S11检测所述两种质粒构建是否成功的方法为：在所述连接的片段扩增后，分别利用Nde I酶和Xho I酶对所述SEF14、SEF21连接的片段进行双酶切；

结果显示457bp的SEF14和3716bp的pET20b(+)片段，说明原核表达载体pET20b(+)-SEF14构建成功；

结果显示568bp的SEF21和3716bp的pET20b(+)片段，说明原核表达载体pET20b(+)-SEF21构建成功。