[发明专利]一种超快速核酸检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸检测方法，具体涉及一种超快速核酸实时荧光定量检测方法。可广泛用于疾病的核酸定量检测，尤其适合用于突发性传染病的快速检测。

背景技术

1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等人发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，使得人们可以在体外有目的地无限扩增特定的核酸片段。其原理类似于DNA的体内复制，只是在离心管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。经过多年的发展，这一技术已经非常成熟，现在已是分子生物学研究和临床诊断领域中最重要和最常用的技术。PCR仪的出现则使该技术实现了自动化，使得PCR的技术应用更加广泛，例如在诊断遗传性疾患、检测临床标本中病原体的核酸、对法医标本作遗传学鉴定，以及分析激活癌基因中的突变情况等方而都得到了广泛的应用。与其同时，针对不用的应用领域，核酸检测技术也发展为很多种类型，其中依赖核酸序列的扩增和环介导等温扩增方法应用也较广泛。但是，核酸检测技术还面临着许多挑战，现有的核酸检测技术中整个扩增时间长达一个多小时、扩增过程也比较复杂，结果不容易重复，尤其是在突发性传染病的检测方面受到了限制。

提高实时荧光定量核酸检测的反应速度，缩短整个检测时间，使其更方便地应用于临床检测，特别是突发性传染病的检测，为疾病的治疗和控制赢取宝贵的时间，则是核酸检测技术未来的一个重要发展方向。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种反应时间大幅度缩短、操作简单的超快速实时荧光定量核酸检测方法，可普遍用于多种类型标本中核酸的分析及临床检测。

本发明所涉及的超快速实时荧光定量核酸检测方法，其特征在于：提取核酸，在特殊的缓冲液和圆盘式反应容器中用荧光标记引物在酶催化下进行扩增并实时定量检测标本中核酸模板的含量。该检测方法通过以下技术方案实现：(1)核酸模板提取：A、样品处理；B、核酸分离；C、核酸沉淀；D、核酸洗涤；E、核酸溶解；F、核酸浓度测定；G、核酸电泳检测。(2)加样：将模板、引物、酶、特殊缓冲液等加入到圆盘式反应容器。(3)荧光定量核酸检测：以特异性引物进行实时荧光PCR定量检测标本中核酸的含量。

所述的特殊缓冲液含有1-100mg/L的甜菜碱作为扩增速度促进剂。所述的圆盘式反应容器为刻有凹槽的圆盘，圆盘直径为1-30厘米，厚度为0.1-3毫米，圆盘上的凹槽数目为1-200个，加样的容积为1-100微升，比起以往的离心管则加热面积更大，热传导效率更高。特殊的缓冲液和圆盘式反应容器使本方法的反应时间比以往的荧光定量核酸检测方法的反应时间大大的缩短了，由原来的1小时以上缩短到现在的5-10分钟，真正实现了病原体感染的快速检测。

该技术有以下优点：反应速度超快，反应时间超短，由传统的1个半小时反应时间缩短到5-10分钟，极大地提高了检测效率，赢得了宝贵的治疗时间；高度特异性，特异的引物确保反应不受其它因素的干扰，对序列高度同源的序列也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级。

综上所述，本发明所涉及的核酸检测技术操作简单，反应时间短，特异性高，尤其适合用于突发性急性传染病的检测，有很高的推广价值。

附图说明

图1为实施例1的核酸电泳结果；

图2为实施例1的圆盘式反应容器的结构示意图。

图中所示分别为：

1、2-纯化RNA样品  3-封盘膜  4-加样孔  5-圆盘位置固定孔

具体实施方式

下面结合附图1和附图2通过一个实例进一步描述本发明所涉及的超快速实时荧光定量核酸检测方法，但本发明所涉及的范围并不局限于本实例。

实施例一

人血液中hsa-miR-29a miRNA的超快速定量检测

1、总RNA提取

(1)样品处理：取100μL～500μL血液标本，加1mL TRIzol试剂，反复混匀；

(2)RNA分离：室温放置上述样品液10分钟，加入氯仿200μL，剧烈振荡约1分钟，室温静置5分钟，4℃12000g离心15分钟，小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA组份；

(3)RNA沉淀：小心吸取上清液约450μL至含有600μL冰冷异丙醇的新离心管中，混匀，4℃12000g离心10分钟；