[发明专利]一种酶法合成亚硝基血红蛋白的方法

权利要求书

1.菌或菌的提取物在制备亚硝基血红蛋白中的应用；

所述菌的提取物按照如下方法制备得到：

发酵巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627，破碎菌体，离心，收集上清液，即为含有亚硝酸还原酶的菌的提取物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述发酵温度为30℃-35℃，所述发酵的时间为20h-30h；

所述发酵温度具体为30℃、32℃或35℃；所述发酵时间具体为20h、25h或30h；

每1L发酵所用培养基按照如下方法配制：将10g-15g葡萄糖，1.0g-1.5g牛肉膏，1.0g-2.0g蛋白胨，1.35g-2g磷酸氢二钾，0.5g-0.7g磷酸二氢钾，1g-2g氯化钠，0.138g-0.15g亚硝酸钠，0.1g-0.2g MgSO₄·7H₂O，0.01g-0.02g MnSO₄·H₂O，0.01g-0.02g CaCl₂·2H₂O和水组成，用水补至1L，调pH为7.0；

每1L发酵所用培养基具体按照如下方法配制：将10g、12g或15g葡萄糖，1.0g、1.2g或1.5g牛肉膏，1.0g、1.5g或2.0g蛋白胨，1.35g、1.5g或2g磷酸氢二钾，0.5g、0.6g或0.7g磷酸二氢钾，1g、1.5g或2g氯化钠，0.138g、0.14g或0.15g亚硝酸钠，0.1g、0.15g或0.2g MgSO₄·7H₂O，0.01g、0.015g或0.02g MnSO₄·H₂O，0.01g、0.015g或0.02g CaCl₂·2H₂O和水组成，用水补至1L，调pH为7.0；

所述破碎菌体的方式为超声破碎，所述超声的功率为200w；所述超声的次数为90次；所述超声的方式为：间歇10s，超声5s；

所述离心力为26000g，离心时间为15min。

3.一种酶制剂，为将权利要求1中所述的菌提取物、苯甲酸钠溶液、壳聚糖溶液混合得到的酶制剂；

所述酶制剂中，所述的菌提取物、苯甲酸钠、壳聚糖的配比为2200U-6200U∶0.5mg-1.5mg∶0.5mg-1.5mg。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述的菌提取物、苯甲酸钠、壳聚糖的配比具体为2200U、3700U或6200U∶0.5mg、1mg或1.5mg∶0.5mg、1mg或1.5mg。

5.一种酶法合成亚硝基血红蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：

将血红蛋白溶液、权利要求3或4所述酶制剂、亚硝酸钠溶液、抗坏血酸溶液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混合，反应，得到亚硝基血红蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述血红蛋白、酶制剂、亚硝酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钠和柠檬酸在混合得到的混合液中的配比为(1-2)mg∶(200-500)U∶(0.0625-0.225)mg∶(1.5-5)mg∶(2.145-3.74)mg∶(0.654-1.475)mg。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：

所述血红蛋白、酶制剂、亚硝酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钠和柠檬酸在混合液中的配比具体为1mg或2mg∶208U、500U或200U∶0.0625mg、0.075mg或0.225mg∶5mg、1.5mg或3.75mg∶3.74mg、2.145mg或2.58mg∶1.475mg、0.95mg或0.654mg。

8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：

所述反应的pH值为5.8-6.6，反应的温度为60℃-80℃，反应时间为5min-20min。

所述反应的pH值具体为5.8、6或6.6，反应的温度为60℃、70℃或80℃，反应时间为5min、10min或20min。

9.权利要求5-8中任一所述方法制备的亚硝基血红蛋白。

10.权利要求9所述的亚硝基血红蛋白在制备着色剂中的应用。