[发明专利]通过对微生物的定量PCR分析来评价土壤健康的方法

说明书

技术领域

本发明是属于生物检测技术领域，一种通过对多种微生物各种基因的定量PCR分析来评价土壤健康的方法。

背景技术

土壤质量是指土壤肥力质量、土壤环境质量及土壤健康质量三个方面的综合量度，土壤在生态系统的范围内，维持生物的生产能力、保护环境质量及促进动植物健康的能力。为监测耕地土壤质量变化，许多国家和地区已经或正在致力于本地区耕地土壤质量监测方法和监测系统的建设。在这方面以加拿大较为领先，加拿大自1989年便在农业部国家基准项目中加进了监测农业土壤健康状况变化。该监测系统的基准数据组包括农场历史、土壤和地貌描述、土壤的各种化学、物理、生物学特性等重要土壤指标的测量。

我国耕地质量和土壤环境监测体系已经基本建立，但仍尚待完善。现有的农田土壤质量监测体系重视土壤物理指标和化学指标的监测，忽略了生物指标对耕地生产能力和土壤质量的指示作用。土壤健康(soil health)是指在生态系统和土地利用上，土壤延续其作为有生机系统的功能，促进大气和水环境的品质，并维持植物、动物和人类健康。因此只靠一些物理化学参数来评价土壤质量是远远不够的。在土壤的功能上最关键的是微生物的作用，而且微生物对各种环境压力(stress)是最敏感的。土壤微生物菌群结构受土壤营养状况、pH值、质地、温度、水分和通气性等条件的影响，任何能改变土壤性质或植被的土地利用方式均可影响土壤生物区系，均可不同程度地影响土壤含水量、温度、通气性、pH值及有机碳和氮的水平。由于土地利用导致的微生物代谢多样性的变化和土壤特性的改变，可能减弱微生物群落对胁迫或扰动的抵抗力。所以微生物作为重要指标的土壤健康评价体系越来越受到重视。

与高等生物相比，微生物还具有快速感应环境压力的能力。它们与周围环境有亲密的关系这归功于表面积与体积比值高。比如说微生物群体或者活性的变化优先于土壤物理化学性质的变化，这个功能可以在土壤优化的早期给出信号或在土壤退化的早期发出警告。例如：1-5年的微生物量的周转率比总土壤有机质的要快。监测荷兰土壤的项目表明了大多数土壤指示确实有判别不同土壤处理的能力。同样这种能力也在美国某个区域中的微生物量和基础的呼吸作用中证明。因此，将微生物指标来作为土壤健康的指标更能反映现实，更能帮助人们了解土壤的健康状况，用科学的方法帮助人们将土地利用最优化。

传统的土壤微生物学研究主要通过测定土壤微生物生物量、土壤微生物活性或者采用平板培养的方法来反映土壤健康的变化。虽然利用分子生物学方法(如：构建克隆文库，变性梯度凝胶电泳(DGGE)，末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)等)的微生物监测已受到重视，但因所用检测方法都不一样，检测设备和实验技术要求高，耗时较长，具有一定的局限性。构建克隆文库的方法虽然能得到准确的序列信息，但缺点是因需要对每个样品进行大量测序，所需要的费用较高。DGGE方法的优点是同时分析和比较多个样品，但缺点是重复性较差，无法进行不同分析之间的直接比较。T-RFLP方法虽然重复性较好，但无法得到每个峰对应的微生物类型的信息。定量PCR是可以从很少的DNA量中可以定量检测特定的微生物种类或类型的方法，很灵敏，操作简单，建立标准曲线后同时检测的样品量较多，也同时在同一批实验中检测多个类型微生物。此方法操作方便快捷，仪器价格相对便宜，因此将可以广泛应用于土壤健康分析中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、简便、易操作的检测土壤健康情况的方法。

本发明提供的检测土壤健康情况的方法，是通过对多种微生物各种基因的定量PCR分析来评价土壤健康状况。具体步骤如下：

1、设计或选定可反映土壤健康的所要检测的各种微生物基因的引物对

根据评价土壤质量的参数选定合适的用于定量PCR的各种微生物基因的引物对，这些微生物如碳循环相关微生物，氮循环相关微生物，细菌、真菌和原生动物含量，菌根、致病细菌以及康生物抗性细菌的含量等(表一)，但不局限于此；

2、构建标准品质粒，制作标准曲线

用所设计的引物对环境样品的DNA进行PCR扩增，对产物用载体pMD 18T构建克隆文库，测序并从中选取合适的质粒作为检测标准品；

用Nanodrop检测标准品的浓度，选择合适的多个稀释梯度进行定量PCR检测(如图3，4，5，6)并建立标准曲线；

3、用MoBio试剂盒提取所要检测的土壤样品基因组DNA；用Nanodrop检测所提取样品的DNA浓度；

4、选择合适的稀释梯度进行定量PCR检测，并根据标准曲线算出样品中特定微生物基因的拷贝数；