[发明专利]一种牛巴贝斯虫LAMP检测方法

权利要求书

1.一种牛巴贝斯虫LAMP检测方法，其特征在于，通过以下技术方案实现：

(1)被检标本DNA提取：取200μl无菌抗凝血液，Trizol试剂裂解后常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，4℃保存备用；

(2)设置LAMP检测试剂盒：由Dof管、阳性对照、阴性对照、Bst DNA聚合酶、SYBR GREEN I染料、dNTP、甜菜碱、10×LAMP Buffer组成；

(3)LAMP扩增：在Dof管中加入处理后的标本DNA，同时设阴、阳性对照，每管反应体系为：1mmol/L FIP，1mmol/L BIP，0.2mmol/L F3，0.2mmol/LB3，4mmol/L MgSO4，0.8mmol/L dNTP，0.8mmol/L betaine，10×LAMP Buffer，1μLDNA模板，加入8U Bst DNA聚合酶大片段，混匀后稍离心，置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：62℃水浴反应60分钟，接着80℃终止5分钟；

(4)扩增产物分析：将扩增产物中加入1∶10稀释的SYBR GREEN I(10000×)1μL，肉眼观察颜色变化，被检标本出现的颜色变化与阳性对照和阴性对照比对，以判定标本为牛巴贝斯焦虫阳性或阴性。

2.根据权利要求1所述的一种牛巴贝斯虫LAMP检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中Dof管含10×LAMP Buffer、脱氧核糖核苷三磷酸、引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP及MgSO₄，引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成的DNA片段：

引物F3    5’＞GGTTGGGCAATGCGTTAT＜3’

引物B3    5’＞TGTCCGTAAGGAAGAACAT＜3’

引物FIP   5’＞CACAATCCCTTTAGCATATGTAGCA＜3’

          GGGCCCTTTCACGCTCAATGTGTTTC＜3’   

引物BIP   5’＞GTACTCAAGCAGATATCTACCATGGGG’

          GCCCAACCTAAGAAAGCAATAGCCATA＜3’

3.根据权利要求1所述的一种牛巴贝斯虫LAMP检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，所述阴性对照为双重蒸馏水。