[发明专利]用于多糖的定性与定量分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于多糖的定性与定量分析方法。

背景技术

多糖是一类由10个以上单糖缩合去水，以糖苷键形式结合形成的多聚 碳水化合物。作为一切生命有机体中必不可少的成分，它与维持生命的能量 代谢及多种生理机能有着密切的联系。近年来，植物、海洋生物及菌类等来 源的多糖因其显著的生物活性如抗肿瘤[林梦感，等.中草 药，2007，38：949-953.]、免疫调节[付书婕，等.时珍国医国药，2008，19：99-101.]、 降血糖[罗祖友，等.食品科学，2007，28：596-600.]、抗氧化[陈旋，等.中国新药杂 志，2007，16：1000-1004.]和抗炎抗病毒[丁保金，等.中国药学杂 志，2004，39：561-563]等引起了人们广泛的关注。然而，由于多糖复杂的结构 与组成，其质量控制长期以来未有突破。多糖的分子量、组成单糖、构象及 糖苷键链接等与其活性密切相关，但如何快速准确地鉴别不同来源的多糖至 今仍是多糖及其产品质量控制亟需解决的关键问题。

目前，通过结构解析进行多糖鉴别的方法繁琐费时、设备要求高、难度 大、实用性差。虽有研究应用组成单糖特征和比例进行多糖鉴别，但酸水解 的选择性差，酸性条件下单糖易被破坏损失而导致结果失真。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、准确的多糖定性、定量分析方法。本方 法将克服现有技术繁琐费时、设备要求高、难度大、实用性差等不足。实现 简便、实用的多糖定性、定量分析。

与酸水解相比，酶水解具有选择性好、特异性高、条件温和等特点，可 获得特异性水解产物，特异性的内切酶水解特性能表征多糖的结构特征，从 而有利于多糖的辨识。此外，酶解结合色谱分析形成的肽谱已广泛成为多肽 和蛋白质鉴别的有力工具[闫妍，等.分析化学，2006，34：187-190.张素艳，等.高 等学校化学学报，2002，23：1246-1250.]。有鉴于此，本发明提出应用多糖对不 同糖苷水解酶的响应特征结合色谱分析，构建对应表征多糖结构信息的“糖 谱”，实现多糖及其产品的快速、准确定性鉴别；并以特征片段为指标，实 现多糖的定量分析。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种用于多糖的定性与定量 分析方法，其特征在于，步骤如下：

(1)、多糖的酶解及验证：多糖水溶液以硫酸-苯酚比色法测定含量，调 节糖含量，平行准备若干份多糖溶液，分别加入适量糖苷酶进行酶解，每1mg (以葡萄糖计)多糖所使用的酶的用量范围为3U～650U，每个酶解反应重 复3～5次；此步骤用以，1)确定多糖的酶解特征；2)确认酶解作用的可重 现性；

(2)、HPSEC-ELSD分析：多糖水溶液及其酶解物经HPSEC-ELSD分析， 比较酶解前、后多糖图谱的变化；多糖图谱酶解前、后未发生明显变化记为 阴性(-)响应；图谱中有特征峰的消失、减小，或者新色谱峰的出现则记 为阳性(+)响应；

(3)、多糖酶解液中糖类成分直接HPLC分析或柱前衍生化后HPLC分 析：多糖酶解残留片段和/或生成的寡糖及单糖，可用反相HPLC-ELSD分析 获得糖谱；也可通过衍生化，改善糖类成分在反相柱上的分离效果和紫外吸 收特性，提高紫外检测和质谱检测的灵敏度，进而提高定性、定量的准确性； 以标准单糖、糖醛酸、双糖等为对照和以色谱峰质荷比(m/z)为参比，进 行糖谱色谱峰识别；其稳定的特征片段，则用作定量分析指标。

(4)、通过上述各步骤的独立或联合应用，即可构建基于结构信息的多糖 酶解响应特征和多糖(酶解)糖谱，实现对多糖的定性、定量分析。

本发明的用于多糖的定性与定量分析方法，是运用以下工作原理：