[发明专利]一种抗癌天然药物筛选模型的建立及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用抑癌基因启动子建立的筛选模型来筛选抗肿瘤天然药物的新方法，尤其是p53基因启动子细胞模型的筛选方法，属于分子药理学技术领域。

背景技术

癌症是严重威胁人类健康和生命的杀手，世界卫生组织预测：2020年癌症患者每年将达1500万。据估计，2005年有760万人死于癌症，并且如果不采取行动，在今后10年将有8400万人死亡，我国每年新发癌症患者250万以上，每年在治患者不下600万，治疗费用超过1500亿元。

癌症是一种基因病，是人体细胞在外环境因素作用下，内在多种前癌基因被激活和抑癌基因失活的多阶段长期演变的过程。目前癌的主要治疗手段是手术、放疗和化疗，尽管医学家们不断完善这3大治疗手段，但许多癌症患者仍然难以得到治愈，化学合成药物在治疗癌症这些病因复杂的疾病上疗效并不理想，而且毒副作用大，现代医药学的局限性开始逐渐显露出来。中国传统医药因其副作用小、具有双向调节作用往往可以补充西药的缺陷和不足。天然药物抗癌药物的研究与开发是国际热门课题，然而过去的用药方向是直接用各种药物抑制或杀死癌细胞，作用机理不够明确、药物作用靶向性差，毒副作用差，药物只有治疗癌症的作用，不能预防癌症及其相关性疾病发生。现在世界癌症研究最前沿的主要课题是修复和激活体内的抑癌基因，通过修复和激活体内的抑癌基因来治疗癌症。

p53基因是一种重要的抑癌基因，是迄今研究最透彻，功能最强大，与人类癌症相关性最高的抑癌基因。野生型p53主要是在细胞周期调控抑制细胞生长、诱导癌细胞凋亡等方面起关键作用。研究表明它与人类50％的癌症有关，例如：肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞癌、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等。人类p53基因定位于17P13，全长16～20kb，有10个内含子和11个外显子，其中第一个外显子不编码，其上游400bp处有启动子P1，下游1kb处有启动子P2，二者为转录起始点。正常的p53基因又称野生型p53基因(wild type p53，wt-p53)，其编码的蛋白质是由393个氨基酸(aa)组成的与细胞分裂周期相关的核磷酸蛋白质，Mr53000，称为p53蛋白，该产物是一种转录调控因子，可通过调节下游的靶基因来诱导细胞凋亡或细胞周期阻滞而抑制癌细胞在体外、体内生长。

分子与细胞水平的药物筛选模型因其具有材料用量少，药物作用机制明确，能够实现高通量筛选等特点，成为目前寻找和发现新药物的主要方法。研究表明利用启动子激活剂选择激活或修复癌细胞中失活的抑癌基因是治疗癌症的一种可行且有效的方法。本发明建立了一种新的天然抗癌药物筛选模型—抑癌基因p53启动子激活剂筛选模型，它是一种灵敏、特效、药物作用靶向性明确的适用于高通量天然抗癌创新药物筛选的新方法。p53基因是人体普遍存在的抑癌基因，开发的药物既可以用来治疗癌症也可以用于预防癌症的发生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏、直接、快速筛选天然抗癌药物的药物筛选细胞模型。该模型建立的方法如下：

首先，克隆p53基因启动子(p53 promoter，p53p)序列：根据已知人p53基因的DNA序列找到其启动子区域，设计包含该启动子全部序列的引物，并在上游引物引入KpnI酶切位点，下游引物引入XhoI酶切位点，以人类基因组为模板进行PCR扩增，得到p53基因的启动子序列，然后将得到的p53基因的启动子连接到pMD-18上并进行测序。将测序得到的序列与已知序列进行比对，以确认该序列即为本发明所需要的p53基因启动子序列。

然后构建pGL-p53p荧光素酶表达载体：将上述克隆的p53基因启动子片段插入pGL2报告质粒中，通过酶切鉴定及基因测序，证明pGL-p53p荧光素酶表达质粒构建成功。

最后建立p53激活剂药物筛选细胞模型并进行药物筛选：将构建的pGL-p53p质粒利用质脂体转染方法转染入人胚肾HEK293T细胞系，用G418进行压力筛选，确定稳定的转染体系。将稳定转染的P53启动子的细胞接种到96孔板中，加入不同的中药提取物，通过化学发光仪检测荧光酶的活性，设对照组，筛选P53基因启动子激活剂。

本发明提供的药物筛选模型，是克隆了人抑癌基因p53的启动子序列及荧光酶报告基因的体外培养细胞。其中，p53基因的启动子序列是药物筛选的分子靶点。所述的p53基因的启动子是克隆了p53基因的第一个外显子上游的P1或下游的P2或连个启动子串联的序列。所选的体外培养细胞优选是人胚肾HEK293T细胞系，体外培养的哺乳类细胞也可以。