[发明专利]N末端聚唾液酸化

说明书

本发明涉及胰岛素的新型多糖衍生物以及用于产生这种衍生物的方法。 所述衍生物可用于改良胰岛素的稳定性、药代动力学及药效学。

糖尿病是一种碳水化合物代谢紊乱，由胰岛素产生不足或对胰岛素敏感 性降低导致。胰岛素在胰脏朗格罕氏岛(islets of Langerhans)的β细胞中合 成，是体内大多数细胞正常利用葡萄糖所必需的。在患有糖尿病的人中，利 用葡萄糖的正常能力受到抑制，从而增加了血糖水平(高血糖症)。

有两种不同类型的糖尿病。I型是胰岛素依赖型糖尿病即IDDM。IDDM在以 前指的是青少年型糖尿病。在IDDM中，胰脏不分泌胰岛素，必须通过外源来 提供。II型成年型糖尿病通常可通过饮食进行控制，但在某些重症病例中需 要胰岛素。

在20世纪20年代胰岛素被分离之前，大多数患者在疾病发作后短时间内死 去。未治疗的糖尿病会导致酮症——酮(脂肪分解的产物)在血液中积聚；随后 是具有恶心和呕吐症状的酸中毒(酸在血液中积聚)。随着紊乱的糖代谢和脂肪 代谢的毒性产物的持续积累，患者会发生糖尿病昏迷。

糖尿病的治疗一般需要定期地注射胰岛素。这产生显著的、挽救生命的临床 改良。然而，由于胰岛素注射的不便，大量努力聚焦于提高胰岛素的给药及生 物同化。

胰岛素分子由两条通过二硫键连接的氨基酸链细成(mw 5804)。胰岛[β]细 胞分泌单链的胰岛素前体——被称为胰岛素原。胰岛素原的蛋白酶解导致4 个碱性氨基酸(胰岛素原链的31、32、64和65位：分别为Arg、Arg、Lys、Arg) 以及连接(“C”)多肽被除去。在形成的双链胰岛素分子中，在A链氨基末端 具有甘氨酸，在B链氨基末端具有苯丙氨酸。

胰岛素可以以单体、二聚体或由三个二聚体形成的六聚体的形式存在。该六 聚体与两个Zn²⁺原子络合。生物活性位于单体中。虽然直至最近几乎只有牛胰岛 素和猪胰岛素被用于治疗人糖尿病，但是现有技术已知胰岛素在物种之间的许 多不同。猪胰岛素与人胰岛素最相似，它与人胰岛素仅有的不同是B链C末端 为丙氨酸残基而非苏氨酸残基。尽管有这些差异，但是大多数哺乳动物胰岛素 具有相当的特异性活性。直至最近，动物提取物提供了所有用于治疗该疾病的 胰岛素。重组技术的出现使得可以商业规模制造人胰岛素(例如Humulin(TM)胰 岛素，可从印第安纳州印第安纳波利斯的Eli Lilly and Company购得)。

已经进行衍生胰岛素的尝试来改良其药代动力学性质。在市场上有一种产 品，即PEG-胰岛素(PEG-insulin)(Nektar Therapeutics)。PEG是一种中性、 溶于水的无毒聚合物，它包含任意数目的环氧乙烷的重复单元。设计聚乙二醇 化(PEGylation)来增加活性分子大小，并最终通过如下途径来改良药物性能： 优化药代动力学；增加生物利用度；以及降低免疫原性和给药频率。PEG-胰岛 素的设计和开发在WO2004091494中被进一步描述。

现有技术已知大量用于产生聚乙二醇化胰岛素衍生物的方法。Davis等人 (美国专利4,179,337)描述PEG-胰岛素构建体的合成，他们使用三氯-s-三嗪(三 聚氰氯(cyanuric chloride))作为PEG和蛋白之间的衔接物。他们遵循这样的 合成方案，即大过量的(50×)三聚氰氯活化的PEG(2000Da)在硼酸盐缓冲液(pH 9.2)中与胰岛素反应2小时。该发明的技术能够产生具有部分活性(约50％)的 PEG-胰岛素轭合物，这种轭合物是非免疫原性的和非抗原性的。Obermeier等人 (加拿大专利1,156,217)发现，依照上文引用的Davis的专利制备PEG-胰岛素 轭合物产生了一种包含大约50％的三-PEG-胰岛素的轭合物的不均匀混合物，并 且其他可能的PEG-胰岛素衍生物结合物(单-PEG-胰岛素或双-PEG-胰岛素)在残 基PheB1位置是未被取代的。